1.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。

定义: 经过某些特定生化反应的修饰来定向改进细胞的特性功能, 运用重组DNA技术来创造新的化合物。

研究内容: 生物合成相关代谢调控和代谢网络理论; 代谢流的定量分析; 代谢网络的重新设计; 中心代谢作用机理及相关代谢分析; 基因操作。

研究手段: 代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。

因此, 在研究方法和技术方面主要有下列三大常见手段:(1)检测技术: 常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究, 如物料平衡、同位素标记示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。

(2)分析技术: 采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法并结计算机技术, 阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理, 如稳态法、扰动法、组合法和代谢网络优化等。

(3) 基因操作技术: 在代谢工程中, 代谢网络的操作实质上能够归结为基因水平上的操作: 涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术, 如基因和基因簇的克隆、表示、调控, DNA 的杂交检测与序列分析, 外源DNA 的转化, 基因的体内同源重组与敲除, 整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。

2. 2.代谢改造思路和代谢设计原理。

代谢改造思路:根据微生物的不同代谢特性, 常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。

(1)改变代谢途径的方法: 加速限速反应, 增加限速酶的表示量, 来提高产物产率。

改变分支代谢途径流向, 提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力, 使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势, 从而提高目的代谢产物的产量。

(2)扩展代谢途径的方法: 在宿主菌中克隆和表示特定外源基因, 从而延伸代谢途径, 以生产新的代谢产物和提高产率。

扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。

(3)转移或构建新的代谢途径: 经过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。

代谢设计原理:现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流: 增加限速酶编码基因的拷贝数; 强化关键基因的表示系统; 提高目标途径激活因子的合成速率; 灭活目标途径抑制因子的编码基因; 阻断与目标途径相竟争的代谢途径; 改变分支代谢途径流向; 构建代谢旁路; 改变能量代谢途径;在现存途径中改变物流的性质: 利用酶对前体库分子结构的宽容性; 经过修饰酶分子以拓展底物识别范围;在现存途径基础上扩展代谢途径: 在宿主菌中克隆、表示特定外源基因能够延伸代谢途径, 从而生产新的代谢产物、提高产率。

3. 微生物的基因操作技术有哪些? ( 举两例说明)微生物的基因操作技术有: 核酸的凝胶电泳、核酸的分子杂交技术、DNA序列分析、基因的定点诱变、细菌的转化、利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究、PCR技术等。

基因定点突变(site-directed mutagenesis): 经过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列, 用于研究氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响, 也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表示载体、引入新的酶切位点等。

主要采用两种PCR方法, 包括重叠延伸技术和大引物诱变法。

在硫化细菌核苷水解酶对底物专一性的研究中, 采用定点突变技术, 对编码221位和228位氨基酸的DNA序列进行突变, 改变两个位点的氨基酸, 从而研究氨基酸残基对底物结合的影响。

基因敲除(gene knock-out): 又称基因打靶, 经过外源DNA与染色体DNA 之间的同源重组, 进行精确的定点修饰和基因改造, 具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点, 可分为完全基因敲除和条件型基因敲除。

在谷氨酸棒杆菌生产缬氨酸的研究中, 采用基因敲除的方法进行高产菌株构建。

如ilv A基因敲除, 使苏氨酸脱氨酶的合成减少, 降低异亮氨酸合成的前体, 从而减少异亮氨酸的合成, 增加缬氨酸的生成。

4. 什么是酶的反馈抑制, 以缬氨酸代谢途径来举例说明。

酶的反馈抑制: 指最终产物抑制作用, 即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节, 所引起的抑制作用, 包括顺序反馈抑制、同工酶的反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制、增效反馈抑制。

以缬氨酸为例: 缬氨酸由丙酮酸合成, 涉及四个反应, 分别由四个酶催化, 依次为乙酰羟酸合酶(AHAS)、乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)。

首先, 由AHAS将两分子丙酮酸缩合成2-乙酰乳酸; 其次, AHAIR将2-乙酰乳酸转化为双羟基异戊酸; 再次, 由DHAD将双羟基异戊酸脱水形成2-酮异戊酸; 最后, TA将2-酮异戊酸转化为L-缬氨酸。

L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成共享AHAS 、AHAIR、DHAD和TA等4种酶。

如AHAS以丙酮酸为底物则合成L-缬氨酸, 而用丙酮酸和2-酮丁酸为底物则合成L-异亮氨酸。

缬氨酸合成反馈抑制的主要对象是其合成途径上的第一个关键酶乙酰羟酸合酶( AHAS) , 同时缬氨酸和异亮氨酸的合成酶系受三个末端产物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的多价阻遏。

因此, 如果解除AHAS的反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物酶系的阻遏, 必将大大提高缬氨酸的积累。

为此可选育缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除缬氨酸的反馈调节。

如抗缬氨酸突变株的获得, 或者利用分子手段对关键酶基因进行定点突变。

5. 微生物酶的自动调节方式( 举两例说明) 。

微生物并不是在所有空间、时间内合成它所能合成的全部酶, 在一定生理条件下只合成它当时所需要的酶, 且酶的活力受到控制。

微生物主要在转录水平、翻译水平、蛋白质水平、不同空间分布和细胞水平上进行酶的调节, 另外对信号传导的响应也起到调节作用。

( 1) 以转录水平上营养阻遏机制为例来说明酶的调节:转录水平上的调节是经过调节酶量进行的。

在细胞培养过程中, 当培养基中含有能被细胞迅速利用的碳源( 如葡萄糖) 时, 其在降解过程中的某代谢产物阻遏了其余降解酶系的合成, 这种现象被称为”降解物阻遏”。

环腺苷酸受体蛋白( CRP) 能与环腺苷酸( cAMP) 结合形成cAMP-CRP复合物。

当cAMP-CRP结合于DNA时, 能促进RNA聚合酶与启动子结合, 从而促进转录。

葡萄糖分解代谢物能抑制腺苷酸环化酶活性并活化磷酸二酯酶, 从而降低cAMP浓度, 不能形成cAMP-CRP复合物, 降低了各种酶蛋白基因的转录, 起到调节相关代谢酶的作用。

( 2) 以蛋白质水平上酶的共价修饰为例来说明酶的调节:酶的共价修饰时调节酶活性的重要方式, 经过其它酶对多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰, 使处于活性与非活性的互变状态, 从而调节酶的活性, 如磷酸化、腺苷酰化、甲基化等。

磷酸化酶激酶催化的反应既能够是经过磷酸化作用使无活性的磷酸化酶b转化为有活性的磷酸化酶a , 也能够是经过磷酸化酶磷酸酶的水解作用使磷酸化酶a脱去磷酸而转化为无活性的磷酸化酶b。

6. 微生物基因水平的调控策略, 请举例说明基因调控是生物体内控制基因表示的机制。

基因表示的主要过程是基因的转录和信使核糖核酸(mRNA)的翻译。

基因调控主要发生在三个水平上,即①DNA水平上的调控、转录控制和翻译控制; ②微生物经过基因调控能够改变代谢方式以适应环境的变化, 这类基因调控一般是短暂的和可逆的; ③多细胞生物的基因调控是细胞分化、形态发生和个体发育的基础,这类调控一般是长期的,而且往往是不可逆的。

基因调控的研究有广泛的生物学意义, 是发生遗传学和分子遗传学的重要研究领域。

原核生物的基因调控主要发生在转录水平上。

根据调控机制的不同可分为负转录调控和正转录调控。

真核生物的基因调控比原核生物复杂得多。

(1)负控诱导系统: 大肠杆菌的lac i基因与乳糖操纵子( lactose operon) 的作用是典型的负控诱导系统。

在这个系统中, i基因是调节基因, 当它的产物——阻遏蛋白与操纵区( lac O) 结合时, RNA聚合酶便不能转录结构基因, 因此, 在环境中缺乏诱导物( 乳糖或IPTG) 时, 乳糖操纵子是受阻的。

而当环境中有乳糖时, 进入细胞的乳糖在细胞内尚存在的极少量的β-半乳糖苷酶的作用下而发生分子重排, 由乳糖变成异乳糖, 异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白紧密结合, 使后者的构型发生改变而不能识别lac O, 也不能与之结合, 因而RNA聚合酶能顺利转录结构基因, 形成大分子的多顺反子mRNA, 继而在翻手水平上合成三种不同的蛋白质: β-半乳糖苷酶、透性酶以及乙酰基转移酶。

( 2) 负控阻遏系统: 大肠杆菌色氨酸操纵子( tryptophan operon) 含有5个结构基因, 编码色氨酸生物合成途径中的5种酶。

这些基因从一个启动子起始转录出一条多顺反子的mRNA, 与lac操纵子一样, 这个启动子受毗邻的操纵区顺序控制。

转录是经过操纵区和阻遏蛋白控制的, 它的效应物分子是色氨酸, 也就是由trρ操纵子的基因所编码的生物合成途径中的末端产物。

当色氨酸很丰富时, 它结合到游离的阻遏物上诱发变构转换, 从而使阻遏物紧紧结合在操纵区。

另一方面, 当色氨酸供应不足时, 阻遏物失去了所结合的色氨酸, 从操纵区上解离下来, trρ操纵子的转录就此开始。

色氨酸起着trρ操纵子的辅阻遏物功能。

( 3) 染色质丢失: 在发育过程中一些体细胞失去了某些基因, 这些基因便永不表示, 这是一种极端形式的不可逆的基因调控。

在某些线虫、原生动物、甲壳动物发育过程中的体细胞有遗传物质丢失现象。

在这些生物中, 只有生殖细胞才保留着该种生物基因组的全套基因。

例如在马副蛔虫(Ascaris megacephala)卵裂的早期就发现有染色体的丢失现象。

蜜蜂的工蜂和蜂后是二倍体, 而单倍体则发育成为雄蜂。

这也能够认为是一种经过染色体丢失的基因调控。

7. 如何采用代谢工程进行缬氨酸育种?答案一缬氨酸生物合成过程分别由四个酶催化, 分别为乙酰羟酸合酶(AHAS, ilv BN基因产物)、乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR, ilv C基因产物)、二羟酸脱水酶(DHAD, ilv D 基因产物)和支链氨基酸转氨酶(TA, ilv E基因产物)。

1)缬氨酸生物合成的调节, 一般采取的方法是用多拷贝质粒表示ilv BNC、ilv D和ilv E基因。