CD4 FITC
CD25 APC
C、选择光谱重叠小的染料
尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7； 选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，
PE/APC；
D、尽量避免偶联染料使用带来的假 阳性
CD8 PE-Cy7 CD3 PE-Cy5
常用荧光素
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。 常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定 量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的 G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 • AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色
荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与 DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料， 一种理想的DNA定量染料。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌 入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于 活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
SP：short-pass filter
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
信号检测与分析系
统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去 除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎 片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必 须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。
• FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
5 %
默认阈 值
32%
升高阈值 后
荧光信号 •细胞自发荧光 •特异荧光素标记激发的荧光信号 •荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管
实验步骤：
•细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
1)荧光素的选择：
A、根据机器配置选择荧光素 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通
道之间的荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
直方图（Distribution Histogram）
•横坐标：道数 •纵坐标：细胞数
散点图（Dot Plot） •横坐标：某细胞参 数相对含量
•纵坐标：该细胞另 一参数含量
等高线图（Contour Plot）
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心管、 培养板、载波片等)
流式细胞术原理及应用
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键 步骤 四、常见流式细胞术应用
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快 速直线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、 快速的定量分析和分选技术.
• 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及 人工合成微球等。
1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大 •荧光信号的面积、宽度和高度
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理， 一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异 范围较大，多使用对数放大。
•线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白含量 •对数测量：细胞膜表面抗原检测
• 荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等) 抗体偶联荧光素； 分子探针结合荧光素Annexin V-FITC；
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自 身发荧光。
• 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性 和定 流动室与液流驱动系统 • 激光光源及光束成形系统 • 光学系统 • 信号检测与分析系统 • 细胞分选系统
流动室与液流驱动系 统
1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样
流动室，430×180um,鞘液
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素
荧光素的强度： 染色指数 Stain Index
Stain Index = D/W
CD4
高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素 分配给表达低的抗原：
CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE
SSC SSC Foxp3 PE
FSC
Injector Tip Sheath
fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
激光光源与光束成形系统
1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器
405nm, 488nm,561nm,635nm
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter