流式细胞仪的原理及应用
马黎明 生命科学与技术学院
流式细胞术的基本概念
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以 流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精 确的对单个细胞理化特性（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行 多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞 及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状 态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上 获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分 选。
此为血细胞分类的基 本原理，但不能分析表 面分子。
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧 光 的 测 量
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料 受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长 不同。
每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色， 通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散 射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增 管。
单参数直方图
量细 胞 相 对 数
信道 (channel )
2.双 参 数 直 方 图
双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细 胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确 定细胞在图上的表达位置。
双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点 密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利 用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒 数量的多少。
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保 证检测的灵敏度和特异性；
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个 参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计 分析精确性。
1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
（1）液 流 系 统
由样本和鞘液组成
（2）光 学 系 统
由激光光源、分色反光镜、光束成形器、 透镜组、滤片和光电倍增管组成。
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（3）数 据 处 理 系 统
主要由计算机和及其软件（BD
FASCDiva和BD ModFit LTTM）组成。
流式细胞仪与显微镜的区别
待测细胞 单个细胞的悬液 对其染色 受清洁气体压力 形成样本流
荧光染料标记的单抗 从样品管进入流动室
鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心 位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
液流系统示意图
液流速度：低速、中速、高速
低速：10ul/min; 中速：60ul/min; 高速：120ul/min.
细胞结构 • 细胞大小 • 细胞颗粒度 • DNA含量与细胞周期 • RNA含量 • 蛋白质含量 • ……
细胞功能 · 细胞表面/胞浆/核的特异 性抗原 · 细胞活性 · 细胞内/外的细胞因子 · 激素结合位点 · 细胞受体 · 钙离子浓度 · 线粒体膜电位
· ……
一、流式细胞仪的工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与 激发效率；
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机
多参数，综合分析
光学显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大
人工 简单，单参数
二、散 射 光 的 测 量
细胞在液柱中与激光束相交时向 周围360°立体角方向散射的光线信 号，它的强弱与细胞的大小、形状、 胞内颗粒折射等有关，主要分为前向 散射光和侧向散射光。
选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞 上的多个不同特征。
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光信号的检测
使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量
四、细 胞 分 选 原 理
通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对 具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进 行的。
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧 向 散 射 光（SS）
侧向散射光（side scatter, SS）： 激光束照射细胞时，光以90°角散射的 讯号，用于检测细胞内部结构属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
光散射测量的用途
测得的FS与SS信号 通过计算机处理，可得 到FS-SS图，由此可仅 用散射光信号对未染色 的活细胞进行分析或分 选。
（一）参 数 说明
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
（二）数 据 显 示 方 式
直分析方图
单参数直方图 双参数直方图:点图
二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析
1.单 参 数 直 方 图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
流式细胞仪的基本概念
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度 的细胞分析仪，是集激光技术、电子物理技术、 光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化 学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高 科技仪器。
BD FACSCanto流式细胞分析仪
流式细胞仪的检测范围
前 向 散 射 光（FS）
前向散射光（forward scatter, FS）： 激光束照射细胞时，光以相对轴较小角 度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测 细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细 胞体积大小成正比。
通常在FCM应用中，选取FS作阈值，来排除样品中的各种 碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。
双参数直方图点图
度红 色 荧 光 强
细胞分选示意图
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴
不充电 弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
五、数 据 的 显 示 与 分 析
参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点
图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散 点图 ） 设门分析技术