Centrifuge QUANTITATE DNA PERFORM PCR
(NO DNA QUANTITATION TYPICALLY PERFORMED WITH UNIFORM SAMPLES)
PERFORM PCR
Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
INCUBATE (ambient)
Centrifuge
REMOVE supernatant
VORTEX Centrifuge
TRANSFER aqueous (upper) phase to new tube
5% Chelex INCUBATE (56 oC) INCUBATE (100 oC) Centrifuge QUANTITATE DNA PERFORM PCR
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DNA指纹技术（RFLP）

实验结果（DNA指纹图谱）：

优点：群体多态性高，稳定遗传，孟德尔遗传 缺点：操作繁琐、对检材的质、量要求较高、灵敏度低、 没有种属特异性
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PCR分型技术（现代DNA亲子鉴定方法）
PCR扩增长度多态性标记（PCR-STR分型） PCR扩增序列多态性标记（PCR-SNP分析） 优点：快速、简便、灵敏、特异，适用于 微量陈旧的生物学检材

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步骤2 样品盘移动



样品盘X、Y、Z三维移 动������ 支持96孔或384孔样品 盘������ 有专门的盛放缓冲液、 水及废液的4个槽
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步骤3 自动电进样和电泳
毛细管和电极进入样 品溶液 仪器开始加电压 荷负电的DNA分子进入 毛细管，并在电场的 作用下向阳极泳动

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孩子的血型不是唯一确定的
除了A型血与B型血的人婚配外，其他血型 组合都有概率为0的不可能事件 只能否定
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蛋白质遗传标记检测的局限性

对检材需要量大，且对时限要求较高，蛋白质容易失活而 得不到理想的结果，不适用于陈旧、微量检材（HLA分型 要求采血后16--24小时内必须检验） 多态性信息含量有限，鉴别能力有限，只能用于父权排除， 准确率较低，不宜用于父权肯定和同一认定 存在有生理或病理性变异（如：A，O型血的人受大肠杆菌 感染后B抗原的检测可能呈阳性）
Only a very small amount of blood is needed to obtain a DNA profile
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样本收集 签发报告 DNA提取
STR检测 的流程
结果分析 ABI3130 毛细管电泳
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多重PCR
DNA的提取
ORGANIC CHELEX FTA Paper
D3S1358 D5S818 D5S818 AMEL
TH01 D13S317
D21S11 D7S820
D18S51
Penta E Penta D
D16S539 CSF1PO TPOX FGA
VWA
D8S1179
ILS600 CXR size standard AmpFlSTR Identifiler™ kit (Applied Biosystems)
8


DNA分子遗传标记的检测
DNA指纹技术（RFLP）：第一代遗传标记
PCR分型技术：第二、三代遗传标记的检测( 微卫星STR位点和单核苷酸多态性SNP)
线粒体DNA SNP
核内染色体 STR
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DNA指纹技术（RFLP）

1985 英国 Jefferys Nature 人源小卫星 DNA 用作基因探针，同人体核 DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上 的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹， 这种图纹极少有两个人完全相同，故称为 "DNA指纹" 实验程序：基因组DNA的提取 限制性内切酶消化酶切 电泳分离 印迹转移 探针制备和标记 分子杂交和自显影
TE buffer CONCENTRATE sample
(Centricon/Microcon-100 or ethanol precipitation)
WASH Multiple Times with extraction buffer REMOVE supernatant PCR Reagents
76bp 81bp 91bp 96bp 101bp 106bp 111bp
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STR的特点
多态性（Polymorphism ）：主要由核心序列拷
贝数目即重复次数的变化，产生长度多态性 目前国内外最广泛应用的遗传标记 多态性信息含量大，准确率高达99.99999%，可 用于个体识别 扩增片段较短（100-300bp），易于检测，适用 的生物检材类型广泛 灵敏度高，50pg，对于检材要求不高
5
ABO血型检查
人的ABO血型是受A,B,O 三个复等位基因控制的， O为隐性基因，A、B为显 性基因。
决定ABO血型的基因型 AO,AA,BO,BB,OO,AB等 6种，表现型有4种：A型、 B型、 AB型和O型；根据 孟德尔遗传规律，即可计 算出孩子的可能血型的概 率。
6
红细胞ABO血型检查
GS500 LIZ size standard
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Figure 5.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
样本收集 签发报告 DNA提取
STR检测 的流程
结果分析 ABI3130 毛细管电泳
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PCR扩增长度多态性标记
微卫星DNA，简短串联重复（STR） 是一种广泛分布在人类基因组中具有长度多态性 的DNA序列。由2-6bp的核心序列头尾相连串联 重复构成，通常重复4-60次不等（串珠结构）

TAGA TAGA TAGA TAGA TAGA TAGA
1
2
3
4
5
13
Apo(a)基因
15
16
DNA条带、重复次数与遗传的关系
17
STR等位基因命名

等位基因通过PCR产物长度来区分和命名
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样本收集 签发报告 亲子鉴定 DNA提取
（STR检测） 的流程
结果分析 ABI3130 毛细管电泳
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多重PCR
检材的收集
血痕



血液 精液 颊粘膜 病理切片 头发 牙齿 骨骼 组织 石蜡包埋组织
200
250
300
350 340
400
450
500 490
250
DNA Size
200
(b)
165.05 bp
160
147.32 bp
150 139
DNA fragment peaks are sized based on the sizing curve produced from the points on the internal size standard
步骤4 荧光激发及检测分析


五色荧光标记的DNA片段按大 小依次通过激光检测区，小片 段在前，大片段在后 激光激发荧光分子，产生荧光 信号 发射的荧光信号被CCD收集 数据收集软件自动将光学信号 转换成电泳图谱中的有色峰， 并通过自动分析软件进行分析
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38
样本收集 签发报告 DNA提取
Sample tray moves automatically beneath the cathode end of the capillary to deliver each sample in succession Figure 12.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press 27
亲子鉴定 的流程
结果分析
ABI3130 毛细管电泳
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多重PCR
肯定案例
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样本收集 签发报告 DNA提取
STR检测 的流程
结果分析 ABI3130 毛细管电泳
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多重PCR
多重荧光PCR
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PCR product size (bp)
PowerPlex 16 kit (Promega Corporation)
FL (Blue) JOE (Green) TMR (Yellow) CXR (Red)
Apply blood to paper and allow stain to dry
Blood stain
SDS, DTT, EDTA and
proteinase K
Blood stain
Water PUNCH
INCUBATE (56 oC) Centrifuge
Phenol, chloroform, isoamyl alcohol
DNA标记： RFLP，VNTR，STR ，SNP
4
蛋白质遗传标记（血型检查）

由等位基因决定的红细胞表面抗原的差异，为最 早用于亲子鉴定的遗传标记，有ABO、MN、P、Rh 等21个血型系统。
特点： 遗传性状简单，符合孟德尔遗传规律 遗传多态性，不易受年龄、性别、疾病影响 操作简单、重复性好，结果明确
蛋白质标记
◆血液细胞表面的标记 ◆血液蛋白质的标记
DNA标记
限制性酶切片段多态性
DNA长度多态性（微卫星STR）
DNA序列多态性
3
遗传标记分类
蛋白标记： 红细胞ABO,Ph,MN,Kell,Duffy,P等21个血型系统 白细胞HLA-A，-B，-C，-D，-DP，-DQ，-DR