免疫组化实验步骤细胞和组织的固定（一）固定为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。
固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。
不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大（二）固定剂用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。
1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。
有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。
1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂2）Bouin’s液该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。
Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。
2．丙酮及醇类固定剂系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。
但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。
C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。
以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。
而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截然不同。
选择最佳固定液标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构。
②最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。
实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。
必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。
固定组织时应注意：①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。
②组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。
③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。
④组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。
石蜡组织标本处理过程1．取材：将动物（如大小鼠）断颈处死后迅速取出所要组织，然后裁成大小为(1cm×1cm×0.5cm)剔除组织上的脂肪和钙化，将组织放入PBS缓冲液中洗涤（直至组织上无血渍为止）2．固定：将组织置于4%多聚甲醛固定液中4℃固定，固定时间和组织厚度成正比（每1mm一小时）3．脱水：固定后的组织经PBS缓冲液洗涤后（浸泡30分钟×3次）放入乙醇中4度剃度脱水1) 70%乙醇4℃3～4h2) 80%乙醇4℃3～4h3) 90%乙醇4℃2～3h4) 95%乙醇Ⅰ4℃2～3h5) 95%乙醇Ⅱ4℃1～2h6) 100%乙醇Ⅰ4℃1.5h7) 100%乙醇Ⅱ4℃1.5h8) 二甲苯Ⅰ4℃0.5～1h9) 二甲苯Ⅱ4℃0.5１～1h10) 石蜡Ⅰ60℃1h11) 石蜡Ⅱ60℃2h以上全过程为18-24h，也可在室温内使用自动脱水机代替。
如组织块小，直径小于0.5cm，可用快速石蜡包埋切片，全过程只需4h左右。
有些组织在切片时易碎（如肝脏），在脱水时可适当缩短脱水时间4浸蜡：将组织浸入液态石蜡中（2小时×2次）严格控制浸蜡温度（60—65℃为宜），防止温度过高导致组织蛋白丢失。
5模具包埋：待蜡完全凝固后4℃保存6切片：要求刀片锋利，切片时尽量避免刀痕与皱折，切片投入50℃左右水浴中，若展片困难时可适度加入几滴乙醇，待完全展开后将其黏附在玻片中央。
7烤片：60℃烤片30分钟，或37℃恒温箱过夜..烤完后切片标本可长期保存免疫组化的试剂准备最重要的是选择好一抗、二抗或者还有三抗，注意抗体的特异性、效价和交叉反应。
其他常用试剂有：1、0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释抗体和洗片子用；2、清洁液、纯水，洗玻片用3、多聚赖氨酸处理载玻片，防止脱片4、固定液：4%多聚甲醛或冷丙酮等；5、15%~30%蔗糖，组织脱水用；6、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，或者OCT包埋做冰冻切片；7、抗原修复液：枸橼酸缓冲液（pH6.0）；或PBS8、活化剂：EDTA或者Triton X-100；9、1%~10%牛血清清蛋白（BSA）封闭液；10、H2O2，灭活内源性过氧化物酶；11、显色液：根据你做的酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用NBT/BCIP，免疫荧光则不需要；12、封片剂。
免疫组化实验步骤工作原理：SABC是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。
链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量47000。
同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。
亲和素是一个碱性蛋白质（IP=10），经改造后可以转变成中性蛋白质。
链霉亲和素等电点接近中性，IP=6.0~6.5，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。
SABC即StreptAvidin—BiotinComplex,。
根据研究，SABC大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。
大量的酶将保证SABC具有很高的敏感性。
SABC兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。
所需试剂：推荐您使用本公司免疫组化试剂盒：1. 5%BSA封闭液：12ml。
用于组织切片的封闭。
2. 二抗：12ml。
亲和纯化抗体，标记长臂生物素。
山羊抗小鼠IgG(或IgM)或兔IgG。
3. SABC：12ml。
链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物。
您还需要的试剂：1．粘片剂APES或POLY-L-LYSINE（博士德公司有售）。
2．0.02 M PBS（pH7.2-7.6）配法：1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g,Na2HPO4 2.8g,NaH2PO40.4g。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
3．0.01M枸橼酸盐缓冲液：1000ml蒸馏水中加枸橼酸三钠（C6H5Na3O7?2H2O）3g, 枸橼酸(C6H8O7?H2O ) 0.4g。
4．DAB显色试剂盒（博士德公司有售）。
免疫组化染色程序的选择：用户需根据抗原/抗体的特点确定程序，多数情况下要先比较各程序染色结果。
A程序：石蜡切片热修复抗原程序。
适于核抗原，易被固定破坏的抗原。
B程序：石蜡切片酶消化程序。
适于被固定遮避的抗原。
C程序：石蜡切片酶不消化/修复程序。
适于稳定的抗原。
D程序：细胞涂片，冰冻切片染色程序。
A.石蜡切片微波修复抗原染色程序:1. 载玻片防脱片剂处理:可选择APES或Poly-Lysine。
捞片后置烤箱58-60℃30-60分以使切片紧密粘附。
2. 切片常规脱蜡至水。
3. 30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。
蒸馏水洗3次。
4．热修复抗原:将切片浸入0.01M 枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次。
冷却后PBS（pH7.2-7.6）洗涤1-2次。
5．滴加5%BSA封闭液,室温20分钟。
甩去多余液体, 不洗。
6．滴加适当稀释的一抗（小鼠或兔IgG），37 ℃1小时左右或20℃时2小时左右。
也可4℃过夜。
PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次。
（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。
一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。
）7．滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔、人IgG),20-37℃20分钟。
PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次。
8．滴加试剂SABC,20-37℃20分钟。
PBS（pH7.2-7.6）洗5分钟×4次。
9．DAB显色:使用DAB显色试剂盒(AR1022)。
取1ml蒸馏水,加试剂盒中A,B,C 试剂各1滴,混匀后加至切片。
室温显色, 镜下控制反应时间，一般在5-30分钟之间。
也可自配显色剂显色。
蒸馏水洗涤。
10．苏木素轻度复染。
脱水,透明,封片。
显微镜观察。
B. 石蜡切片酶消化程序:以下面的步骤代替A程序中的第4步:滴加复合消化液(博士德有售)5-10分钟。
蒸馏水洗3次。
也可以使用0.1%的胰蛋白酶作消化液。
C. 石蜡切片酶不消化/修复程序:对于不需要微波修复或消化的抗原,省略A程序中的第4步即可。
D.血涂片，细胞和冰冻切片染色程序1.载玻片经防脱片剂处理（Poly-L-Lysine）。
2.抗凝血经分层离心后涂片；培养细胞也可涂片或贴片生长；冰冻切片室温风扇吹干。
3.固定方案首选4%多聚甲醛或10%福尔马林固定30分钟；对不能耐受甲醛固定的抗原，纯丙酮室温固定30分钟。
蒸馏水洗。
（干燥后可冰冻保存）4. 30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温浸泡30分钟，以灭活内源性过氧化物酶。
蒸馏水洗3次。
其余步骤和石蜡切片5-10步相同。
注意事项：如果染色背景过高，在SABC反应之后，DAB显色之前,用加有0.01—0.02%TWEEN20的PBS（pH7.2-7.6）洗涤切片4次，单纯PBS洗2次，然后DAB 显色。