检测步骤
1.3 单重RT-PCR
单果重RT-PCR用2P电5CMμR泳-LMb检PuLC测fVfeR结反r 标［转准7录5反0酶m应反m体转o系l录/L:合1T4成r．is各-H3病Cμl毒L( pdcHdDH8N．2AO8第，) 一2，．链2050μmLm10ol×/L 以TMV、CM(2VNμ、HLT4dEN)V2T、SPO( 各4，2．0．5m1%moTlw/Le)e，n210］μL，上2游μL和2下5 游mm引o物l /混L M合g物Cl2， PVY 和TVBM( 各V 150种μm病ol /L) ，0． 2 μL Taq DNA 聚合酶( 5 U /μL) 和2 μL 毒的反转录产cD物N作A 为模P板C。R PCR 反应循环参数: 94℃预变性3 min; 94℃变性 反应的模板，30经sP，C4R8℃扩退火30 s，72℃延伸1 min，循环30 次; 72℃延伸 增分别得到大10小m为in2。37取、5 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较 273、347、456 和547 bp 的5 条特异性条带
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1．2引物的设计与筛选
应用Primer Premier 5． 0 引物设计软件分别设计这5 种病 毒的特异引物TMV cpF /TMV cpR、CMV cpF /CMV cpR、 TEV cpF /TEVcpR、PVY cpF /PVY cpR 和TVBMV cpF /TVBMVcpR。由于多重RT-PCR 要求在同一退火温度下同 时扩增多个目的片断，因此对设计的大量引物进行筛选， 选择Tm 值较一致的各对引物，以保证在同一退火温度下同 时检测到TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 这5 种病毒
病毒混合侵染烟草的检测
2007 －2008 年对陕西泾阳、乾县等烟区进行采样调查，样 品检测结果显示: 烟草花叶病毒( TMV)、黄瓜花叶病毒 ( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病毒( PVY)和烟 草脉带花叶病毒( TVBMV)都有发生，且多为复合侵染. 采集复合侵染的烟叶进行多重RT-PCR 检测，结果显示烟草 中2 种、3 种和4 种病毒复合侵染都存在。
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1.4 多重RT-PCR
优C1板∶.M4化的PV∶V后比∶Y1的例∶T∶为5ETV对VT1BM∶引∶多 P反 R加MV物VPTV1重转入∶VY-比=∶PYCR录一例1:1和CM．T.T为5合个VRVT，-4BTP∶V∶成反5M反MCB种VVT1c应R应ME∶=∶模DV管V的反NA5进模应，种行板体将病P，系RC毒将:TR取的各产反T混病M物应合毒V随。、病特机C株异混M提性合V取、引作总T物为ER同V多N、时重A， 1∶ 1∶ 1． 6退。。火结温果度分别选择42℃、45℃、48℃、51℃、 显示，退火温度54在℃48和℃和575℃1℃;所延伸时间分别为40、50、60、70、 获得的目的条带80相和对较90好。s;延循伸环次数选择20、25、30、35、40 时间在60 和90和s4能5获个得循理想环的进结行多重RT-PCR体系优化
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1．1 病毒总RNA 的提取 TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 核酸均为线状单链正义 RNA。植物总RNA 的浓度及纯度是影响RT-PCR 检测的关键 因素，其提取方法有十二烷基硫酸钠和硫氰酸胍抽提等，但 是这些方法中提取缓冲液的配置操作繁琐，提取过程耗时长， 容易造成总RNA 降解。为高效、快速提取植物总RNA，并对 植物病毒进行PCR 检测，本研究用Biozol试剂盒提取烟草总 RNA，并进行多重RT-PCR同时快速检测TMV、CMV 、TEV、 PVY 和TVBMV等5 种主要烟草病毒
小结
一直以来多重RT-PCR 灵敏度没有单重RT-PCR 高。本研究针 对影响多重RT-PCR 的引物浓度、Mg2 + 浓度和退火温度等 方面进行优化。研究发现，引物设计是多重RT-PCR 中非常 关键的一步。引物的选择对实验的成败起着关键作用，既要 使引物具有特异性，又要避免引物之间的相互影响，同时要 尽量使各对引物的退火温度相一致。通过Blast 在线序列比 对调整引物，使各条引物之间尽量不存在互补，有效减少了 引物二聚体的存在。设计引物时使各对引物的Tm 值较一致， 保证在同一退火温度下同时扩TMV、CMV、TEV、PVY 和 TVBMV 5种病毒 DNA 扩增片段的大小是影响多重RT-PCR 的另一个重要因素， 若片段大小差别过大会影响到片段延伸时间的设定，因此本 研究扩增5 个片段大小选择在200 ～ 500 bp 之间。由于多重 RT-PCR 需要在同一体系中同时扩增出多条片段，扩增片段 的大小存在差异，再加上不同引物的特异性程度不尽相同， 因此引物浓度和模板的量是影响多重RTPCR的一个至关重要 的因素，在建立多重RT-PCR体系的过程中需要对引物浓度和 模板的量进行反复摸索，以获得一个最适量
我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒 ( TMV) 、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草 蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病( PVY) 和烟草脉带花叶病( TVBMV) ，通常发 生复合侵染。本研究对我国5 种烟草病 毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物， 建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、 PVY 和TVBMV 的多重RT-PCR 检测 体系。对田间样品检测结果证明，多 重RT-PCR 体系能够同时检测5 种病毒， 并且灵敏度高
目前检测手段
目前检测烟草病毒的主要方法有电镜法、血清学鉴定以及 PCR 技术。其中PCR 技术具有快速、便捷、灵敏度高和 特异性强等显著优点。
多重RT-PCR技术：多重PCR 是在同一反应体系中加入两 对以上特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应， 具有高效性、系统性和经济简便性等特点，现在已应用于 基因诊断和病原微生物的检测与鉴别。
果，而且40、50、70 和80 s 之 间没有明显 的差别(
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1. 6 PCR产物的克隆和测序
多重RT-PCR 扩增DNA 靶片段采用H.Q.＆.Q.凝胶回收试 剂盒回收纯化后，纯化的PCR 产物与pMD18-T simple vector 4℃ 过夜连接，采用CaCl2 法制备大肠杆菌JM109 感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp 抗性 和半乳糖苷酶的底物X-gal 进行蓝白斑筛选。阳性克隆经 菌落PCR 和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒委 托金思特科技( 南京) 有限公司测序。
五种烟草病毒TMV、CMV、 TEV、PVY 及
TVBMV 的多重RT-PCR同步检 测
植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 41( 2): 146-153( 2011)
介绍
烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus； TMV），又译为烟草花叶病毒，是一 种RNA病毒，专门感染植物，尤其是 烟草及其他茄科植物，能使这些受感 染的叶片看来斑驳污损