评价应激的方法及抗应激添加剂的研究进展李昊阳1，2，钟荣珍1，2*，杨连玉1（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所，长春130012）摘要：在动物生长过程中，应激是一种严重制约动物生长和健康的因素，常导致巨大的经济损失。
及时准确地评价动物应激状态，采取有效的防控措施是十分必要的。
本文从应激过程出发，总结了应激的特征评价指标，包括常规的生理生化指标、急性期蛋白（APPs）、热应激蛋白（HSP），并以抗氧化剂为例，简要介绍了抗应激添加剂的研究进展。
关键词：应激；急性期蛋白；热应激蛋白；抗氧化剂动物生长是一个受遗传、营养和环境等诸多因素影响的复杂过程。
近来，随着高密度、集约化养殖方式的不断推广应用，动物生长受环境因素的制约越来越大，生产过程中的各种应激问题愈发突出。
应激能够影响动物生活状态，降低生产性能和畜产品质量，导致巨大的经济损失，因此，及时准确地评价动物的应激状态，采取有效的防控措施在生产实践中有重要意义。
1 应激的概念应激是一个复杂的概念，涉及精神、神经、内分泌和免疫等方面，有着很多种定义，它是多个事项的集合，包括刺激物（应激原）促使大脑产生反应（应激感知），以及活化体内生理学的战斗-逃跑反应[1]。
在现代畜牧工业化生产中，应激原随处可见，如惊吓、运输、环境剧烈变化、屠宰、更换饲料和注射疫苗等[2]。
2 应激的神经调节及其对营养代谢的影响动物受到应激原刺激后，中枢神经系统识别刺激，随后机体组织发起一系列的生物学反应进行防御，包括行为反应、植物性神经系统反应、神经内分泌系统反应及免疫系统的反应。
首先，应激会引起交感神经系统和HPA轴(下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴)兴奋，导致儿茶酚胺的快速短期释放；随后，糖皮质激素被释放到循环中[1]。
皮质醇和儿茶酚胺类物质可以调节细胞的运输、增生、细胞因子分泌、抗体的合成[3]。
神经内分泌系统与免疫系统之间存在相互作用与相互影响，在这个网络中，神经系统通过神经递质和神经肽、内分泌系统通过激素、免疫系统通过细胞因子相互间对其它两个系统进行调节，使机体内环境稳定[4]。
例如，糖皮质激素（glucocorticoid, GC）可以调节多种免疫细胞的功能，包括：IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12，以及粒细胞的巨噬细胞集落刺激因子[3]。
应激原引起的神经兴奋还会影响动物体的营养代谢，其反应途径主要有两种：（1）刺激垂体，肾上腺皮质激素分泌增多，蛋白质分解加强，糖原异生作用加强。
（2）交感神经系统兴奋，儿茶酚胺增多，进而胰岛素分泌减少，胰高血糖素和肾上腺素分泌增多，导致应激性高血糖，甚至出现尿糖。
与之同时，含量增多的儿茶酚胺还会直接导致代谢率上升、生热作用上升；直接或通过刺激生长激素分泌增多间接导致脂肪分解和糖异生作用增强，血浆游离脂肪酸和酮体含量增多。
为了适应应激，动物会进行一系列的行为上和代谢上的改变。
如食欲下降、嗜睡等；能量的供应由生产、繁殖转向维持生存和免疫应答。
正常状况下机体利用养分的优先次序为：神经系统>免疫和淋巴组织>内脏器官>骨骼>肌肉组织>脂肪组织，应激时，这种优先次序发生改变，肝脏和骨骼肌首先被动员，作为提供能源的重要底物[5]。
对动物的生长和代谢而言，细胞因子起着营养重分配剂的作用。
在许多重要的活性代谢组织，如脂肪组织、肝脏和骨骼肌细胞上均有TNF-α的特异性受体。
IL-1、TNF-α、IL-6均可使用于生长和骨骼肌蛋白质沉积的养分转向用于维持机体免疫应答的相关过程，主要包括免疫细胞的分化和增殖、抗体的合成及肝脏急性期蛋白质的合成等[6]。
3 评价应激反应的特征指标3.1 常规的生理生化指标经常用来衡量应激的生理生化指标有心率、血压、儿茶酚胺、皮质醇、乳酸盐、葡萄糖、游离脂肪酸（FFA）的浓度，以及肾上腺素、促肾上腺皮质激素、肾上腺皮质激素、甲状腺素、高血糖素、生长激素等应激激素[7]。
测定糖皮质激素浓度是最常见的衡量HPA轴活性的方式。
哺乳动物分泌的糖皮质激素主要是皮质醇，而啮齿类和禽类主要是皮质酮[1]。
通常，血液、唾液、尿液、粪便等样品，适用于急性应激的糖皮质激素浓度测定；而毛发样品则适用于评价长期应激[8]。
Caroprese等[9]研究表明，血液皮质醇浓度同母羊的行为、免疫能力、细胞因子浓度有关。
应激条件下，活跃的HAP 轴可以促进免疫应答以及母羊机体对应激状况的被动反应；并且同产奶量、增强乳腺炎诱因有关；而IL-1β和IL-6均可以用作为HPA轴强度的指标。
而乳中的皮质醇浓度会依据泌乳期、产次、产奶量和乳成分发生改变[10]。
3.2 急性期反应蛋白急性期反应（acute phase response, APR）是由多种刺激如感染、组织损伤、肿瘤生成、免疫紊乱引起的先天性非特异性免疫反应，描述了应激时血浆蛋白成分的变化。
这个复杂的反应由促炎症细胞因子（主要是IL-6、IL-1、TNF-α）和局部及全身反应来调节，包括发烧、促进肌肉蛋白分解、改变睡眠和食欲、以及改变血中急性期反应蛋白（acute phase proteins, APPs）的浓度[11]。
这些蛋白主要由肝脏合成，并且依据转化方向与其在急性期内的浓度变化程度（较少、中等、较多）分为两类：浓度增加，称为正相APP；浓度降低，则称为负相APP。
应激产生后，机体的APPs的合成调控途径如图1所示[12]。
现今，还不清楚不同APPs之间是否存在相互作用。
到目前为止，已知巨噬细胞分泌的细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6会诱导APPs的释放，但确切的调节机制还不完全清楚[13]。
诸多试验证明，机体感染病菌、病毒后，APPs浓度增高，并且，APPs已经被用作人和动物的评价健康的指标。
Gånheim等[14]研究证明，检测APPs可以有效地监控小牛日常健康状况。
动物在送往养殖场或屠宰场时，通常需要经历长途运输，而运输前的管理、噪音、震动、混群、拥挤、气候条件、拘禁、装载与卸载、运输时间、缺乏食物和饮水[15]，以上这些因素都会产生强烈应激，影响肉品质和终产品的价值。
猪在经历运输应激后，猪体内Pig-MAP、结合珠蛋白（HPT）、血清淀粉样蛋白A（SAA）、C反应蛋白（CRP）增加；载脂蛋白A-I降低[16]。
另外，猪在运输途中发生的咬尾、咬耳和食物的变更也都会导致APPs浓度增加。
特别是HPT和pig-MAP，它们是测定猪的APPs 最稳健的指标[17]。
激活，抑制图1：急性期蛋白合成调控[12]Fig.1. Regulation and induction of acute phase protein3.3 热应激蛋白在细胞水平，所有的动物的应激应答都由热应激蛋白（heat stress proteins ,HSPs）综合处理，而HSP可以保护细胞免受损伤[18]。
在受到环境中的各种应激原（通常为热应激）的刺激后，生物有机体细胞内可迅速启动基因复制、mRNA转录，从而产生一组具有高度保守序列的蛋白质，称之为热应激蛋白[19]。
许多应激原，如发热、营养缺乏、氧化和中毒，以及同炎性细胞因子接触，都能诱导HSP的表达。
依据分子量的不同，HSP可以分为HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、HSP40家族，以及小热应激蛋白家族[20]。
运输应激对不同家族的HSP的mRNA转录水平影响不同。
李玉保等[21]报道称，经1、2、4、6、10h的运输刺激后，猪体内HSP70的mRNA的转录水平随着运输应激时间的上升一直呈上升趋势，而HSP90的mRNA的转录水平则呈现下降趋势。
在应激下，HSP70的增加最为显著，它包括HSP72和HSP73两种结构。
Sepponen等[18]检测小肠和结肠内因应激诱导产生的HSP72的浓度，并且同血清乳酸盐、血液皮质醇、葡萄糖、游离脂肪酸、APPs这些常规的应激指标相比较。
该试验结果表明，由运输和宰前处理引起的应激会改变肠子的细胞通透性，使血清里的HSP72增多。
结肠中的HSP72浓度同血中HSP72浓度相关，但与胴体重呈负相关。
结肠的HSP72浓度可以反映肠上皮对如运输和操作处理等应激原的应答状况，可作为一种有效的猪的慢性应激指标使用。
4 抗应激饲料添加剂在集约化生产中，动物无法凭借自身的行为调控有效抵御应激，因而，人为的调控措施就显得尤为重要。
在动物日粮中添加适宜的抗应激饲料添加剂就是一种有效的抗应激调控措施。
常见的抗应激饲料添加剂有：维生素类，如维生素C、维生素E等；矿物元素类，如铜、锰、锌、硒等；人工合成抗应激剂，如二丁基羟基甲苯（BHT）和丁基羟基茴香醚（BHA）等；天然抗应激添加剂，如复合中草药、植物多酚等。
动物和人的健康都源于细胞水平，预防细胞损伤可以促进和保持健全的细胞功能和免疫功能；并且，很多应激都会导致氧化应激，所以，使用抗氧化剂是一种主要的抗应激饲料添加剂。
维生素类添加剂就是一种常见的抗应激添加剂，而且，很多维生素都具有很高抗氧化能力。
例如，维生素A能结合过氧化氢[22]；人为补充维生素C能缓解应激引起的维生素C缺乏[23]；维生素D能正相调节体内抗氧化防御系统[22]；维生素E可以增强机体巨噬细胞的活性、细菌杀伤、外周血和乳腺嗜中性粒细胞的氧化代谢[24]。
高温环境下，单胃动物体内的维生素C含量下降；特别是在禽类的研究中，大量研究证明，饲喂维生素C能够有效缓解热应激，并且已经广泛应用于生产实践当中。
在反刍动物方面也有这方面的的研究。
例如，Padilla等[23]报道，高温会导致牛的产奶量和采食量均有所下降，体内维生素C的含量显著下降，供给维生素C能缓解奶牛热应激。
Morán等[25]在美利奴羊的日粮中添加0.6g/kg维生素E，饲喂7周后，对羊进行4小时的运输应激试验，结果表明，运输应激刺激HPA轴和交感肾上腺系统，促进骨骼的中性白细胞的释放和淋巴细胞的再循环，饲喂添加维生素E的日粮的动物跟对照组相比，动物体内活化的粒细胞数量更多，单核细胞计数也更多，说明维生素E具有免疫学作用，能够保护组织抵御运输应激。
Aktas等[22]将两种联合添加剂，维生素A+D+E和维生素E+硒，分别饲喂荷斯坦奶牛，随后将牛进行长时间运输。
研究显示，长时间运输应激会活化HAP轴和交感神经系统，但HAP活化程度更高，因而，肾上腺素比去甲肾上腺素和多巴胺更适合评价牛的长时间运输应激；而且，这两种联合剂都可以降低长时间运输所导致的丙二醛（MDA）水平，抵御脂质过氧化作用和氧化应激。
人工合成的抗氧化剂也广泛应用与生产实践中。
如BHT和BHA曾分别于1940和1954年被美国食品和药物管理局(FDA)批准作为食品抗氧化剂使用。