5. (1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%
（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上 清于离心管，弃沉淀。 (2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60% （0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清， 沉淀用3ml 0.5M Mg(AC)2溶解,记录体积c。取 0.1ml作为C液于EP管,待测比活性用。
影响有机溶剂沉析的主要因素
• 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率 （溶解度下降）；
• 搅拌速度：散热 • 溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的
电荷，防止共沉现象。（pI） • 离子强度:离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L • 样品浓度: 0.5~2%
稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 • 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+
管号
空白
酶液体
蛋白标准液
Tris-Mg(AC)2 0.1
BCA试剂
1.5
标准 A
B
CD
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
2. 混匀后37℃水浴30min, 562nm比色（小比色杯）
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）酶活性测定
管号
空白
标准 A
B
CD
酶液体
AKP纯化程度鉴定
• AKP纯化程度用酶的比活性反映。 • 酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
(三)碱性磷酸酶的蛋白含量测定
BCA法测定AKP蛋白浓度
BCA (bicinchoninic acid, 二喹啉甲酸)
Protein + Cu2+ OH-
BCA 试剂
Cu+
紫色复合物
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）
碱性磷酸酶
实验目的:
从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验， 培养同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分 光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋 白质的技能。
实验原理：
采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱 性磷酸酶。
AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP 和其他蛋白分离，从而得到纯化。
6.
（1）其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分
数达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min， 取上清（弃沉淀）
（2）上清中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到
50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min，弃上 清 （3）沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶 液。作为D液用于比活性测定。
• 用于活性测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将 A液稀释25倍、B液稀释10倍、 C液稀释5倍，D
液不稀释。 • 用于含量测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将
A液稀释50倍、B液稀释20倍、 C液稀释5倍，D 液不稀释。
(二)碱性磷酸酶的活性测定
实验原理： AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适
酚标准液
Tris-Mg(AC)2 0.1
复合底物
3.0
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
2. 取试管6支编号（体积单位为ml）酶蛋白含量测定
管号
空白
反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度 的AKP。
有机溶剂沉淀
• 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的 有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。
• 原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电
引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的
浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低 了亲水性，导致脱水凝聚。
pH范围为8.8~10, 需要镁离子作为激活剂。 血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
酶的活性通常是在一定条件下（最适温度、最适的pH、必要的激动剂 等），一定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物的 生成量来确定。
AKP
磷酸苯二钠
磷酸盐 + 酚
铁氰化钾 酚 + 4-氨基安替比林
3.滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇， 混匀后3000r/min 5min。弃上清，沉淀 用4ml 0.5M Mg(AC)2溶解。记录体积b。 取0.1ml作为B液于EP管，待测比活性用。
4. (1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%
（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上 清于另一离心管。 (2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60% （0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清， 沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。
常用的有机溶剂沉析剂
• 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋 白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；
• 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用 范围不广；
• 特点：
– 介电常数小: 60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22
– 容易获取
有机溶剂沉析的特点
• 分辨率高； • 溶剂容易分离，并可回收使用； • 产品洁净； • 容易使蛋白质等生物大分子失活； • 应注意在低温下操作；
红色醌类衍生物
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）
管号
空白
酶液体
酚标准液
Tris-Mg(AC)2 0.1
复合底物
3.0
标准 A
B
0.1 0.1 0.1
3.0 3.0 3.0
CD 0.1 0.1
3.0 3.0
2. 加入底物后, 立即混匀, 37 ℃ 准确15 min 后加入0.5%铁氰化钾2.0 ml终止反应, 混匀, 静 置15 min , 510 nm比色（大比色杯）
1.称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合 液4ml, 进行匀浆。转入离心管，并加2ml 0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合 液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积a， 取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。
2.在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇， 玻璃棒搅拌 2min，室温放置30min，纱 布过滤，置于离心管。