细胞融合一、实验材料手术剪，镊子，离心机，蜡盘等。

二、实验所配试剂1640基础培养液：取一包1640干粉，溶于1000 mL双蒸水中，慢慢加入2.5 g NaHCO3，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用。

青链霉素溶液（100×）：取青霉素100万单位和链霉素1 g，无菌溶于100mL已灭菌的三蒸水中，0.22 μm滤膜过滤除菌，1 mL/管分装，-20℃冻存备用。

1640完全培养液：向1640基础培养液中加入10％的小牛血清和1%青链霉素溶液（100×）（为养成良好的操作习惯，建议不加最好），摇匀，4℃冰箱保存备用。

HT培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入1 mL 100×的HT溶液，摇匀，4℃冰箱保存备用。

HA T培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入2 mL 50×的HA T溶液（使用前HA T有部分白色沉淀应充分混匀），摇匀，4℃冰箱保存备用。

GNK溶液：准确称取KCL 0.4g ，NaCL 8g ，Na2HPO4·2H2O 1.77g(Na2HPO4·12H2O 3.56g)，NaH2PO4·H2O 0.69g(NaH2PO4·2H2O 0.78g)，酚红0.01g，葡萄糖2g，加DDW 定容至1000mL，调节pH 值至7.2，115℃高压灭菌，4℃保存备用。

三、实验步骤1.免疫小鼠选择6-8周龄的Balb/c雌性小鼠进行免疫，免疫剂量50μg/只，皮下注射。

免疫程序如下：首次免疫：100μL抗原+100μL弗氏完全佐剂/只加强免疫：100μL抗原+100μL弗氏不完全佐剂/只，于首免后2周后进行。

共免疫3次，每次间隔2周。

第二次免疫后的第十天断尾采血（一般尾部采血4μL，溶于200μL PBS混匀备用）检测效价，如果效价很低或没有效价，建议直接放弃，不用继续再免疫。

如果效价可以，在二免后的2周进行三免，最后一次免疫10天后，断尾采血，用适当的抗原进行包被，用间接ELISA检测抗体效价，效价达到1:1600以上即可进行细胞融合。

超强免疫：最后一次加强免疫后2周，细胞融合前3~5天，尾静脉或腹腔注射50μg纯抗原。

2. 饲养细胞的制备融合前1-2 d制备饲养细胞。

取昆明鼠1只致死（收集小鼠血清，以供筛选时用该血清做阴性对照），75%酒精消毒体表，无菌手术剪刀轻轻剥去小鼠的腹部皮肤，以防止剪破腹膜，暴露腹膜。

然后用5mL注射器和16号针头将5mL预冷的HAT打入小鼠腹腔，轻轻压挤腹部，重新吸出注入的液体（在吸取过程中为防止污染，避免针头刺破肠管），收取小鼠腹腔巨噬细胞。

用HAT稀释至40ml，100uL/孔添加到4块96孔细胞培养板中，置37℃5% CO2培养箱中培养，第二天检查有无污染情况。

3. 细胞计数为保证NS0细胞在融合时达到最佳状态和高活力，建议在融合时前一天给所需的每瓶NS0细胞换液，以备融合时使用。

80%左右NS0的细胞计数（三次平均数）：（11.6×105+9×105+3.7×105）/3=8.1×105/mL脾细胞计数6.5×106/mL,大约是40mL有 2.6×108个细胞，两次计数相差不大，所以脾细胞数可固定为2.6×108个/40mL。

NS0细胞计数：3.7×105个/mL（70%）9×105个/mL（80%）11.6×105个/mL（90%）脾细胞计数：4. 细胞融合在40℃水浴中预热GNK溶液、PEG和HA T溶液；免疫小鼠采血并分离血清，然后致死浸泡到酒精中；收集NS0细胞于50 mL离心管中（为保证高融合率建议大于4瓶90%的NS0细胞），1000 r/min离心10 min，弃上清，用GNK洗一次；5小鼠脾细胞的制备依次剪开小鼠皮肤，腹膜暴露腹腔（建议为防止污染，建议至少用两套手术刀具，一套用于剥开小鼠外部皮肤和腹膜，另一套用于取出小鼠脾脏），取脾脏放置与尼龙纱布上充分研碎，并用GNK洗下去，收集脾细胞于50 mL离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，打散细胞团；将脾细胞与NS0骨髓瘤细胞混合于50 mL离心管中，加GNK溶液至40 mL，1000 r/min离心10 min，弃上清，打散细胞团（充分打散细胞团，以保证融合时的高融合率）；为保证融合时的温度可以事先将混匀好的细胞在40℃水浴预热两分钟，然后在另一刚取出的40℃水浴烧杯中做融合，用1mL或大于1mL吸管将预热的50%PEG（pH8.0）滴加到融合管中，边加边轻轻摇动融合管，1min或80s内加完，并继续在水浴中缓缓摇动融合管1.5min。

立即缓慢滴加37℃预热的GNK溶液15mL。

加入步骤为：1 mL/30s，3 mL/30s，11 mL/30s。

然后慢慢补加GNK溶液至40mL，37℃水浴静置5min，1000 r/min离心10 min，弃上清。

打散细胞团，加40mL HA T完全培养具吹打混匀，加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100μL，置37℃5% CO2培养箱中培养。

克隆细胞的筛选、转孔及亚克隆一、融合细胞的培养1、融合后的细胞置于CO2培养箱中培养，次日检查有无污染，如发现污染立即滴加1%的NaOH。

2、一般2～3d可见小克隆；7d时于出现克隆的孔内半量换液（注意：37℃预热HA T培养基）；3、10d左右可以吸取少量上清用于筛选（一般吸取50～100µL），并补加等量的HA T培养基（换液时应轻柔，以减少对克隆细胞的损伤）；4、14d左右对所筛选的阳性孔可半量更换HT培养基，同时对筛选阳性孔的细胞转至24孔培养板中扩大培养，准备克隆化。

在筛选过程中将HA T培养基逐渐更换为完全培养基RPMI1640/10。

二、筛选（1）包被。

将抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每块酶标板以5-20ug抗原为宜（如果抗原为多肽或小分子物质，则需要加大包被量，如果是纯化病毒根据病毒的浓度做1:400-1000倍稀释）。

每孔的包被体积为50ul。

37℃包被2h或4℃包被过夜。

（2）封闭。

倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体，5% 脱脂牛奶（PBST 溶解）或其它无关物种血清于37℃封闭2h，封闭完后可立即使用，也可以洗涤一次置于4℃密封保存以备后面使用。

（3）一抗。

封闭完后，弃去孔内液体，拍干，用封闭液1:1稀释待检测克隆孔上清，每孔50ul为宜。

同时做阳性（融合小鼠血清1:500-1000倍稀释）和阴性（所制备饲养细胞小鼠血清1:200倍稀释）及空白对照（所稀释抗体用封闭液）和无克隆孔上清对照。

在每块板子上做好标记。

37℃孵育30min。

（4）二抗。

孵育完一抗后，弃去孔内液体，拍干，以PBST洗涤3次，每次5min。

根据二抗说明稀释二抗至适当比例，每孔加入50ul，37℃孵育30min。

（5）显色。

孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，加入显色剂，37℃显色5-10min，拍照记录检测结果，筛选出阳性较强的克隆进行特异性检测。

三、特异性筛选对筛选的强阳性克隆孔进行特异性筛选，如果是用大肠杆菌表达的蛋白，可以用载体蛋白、正常大肠杆菌上清以及其它无关蛋白进行包板检测；如果是细胞毒免疫的可以用正常细胞的裂解液包板检测；如果是组织毒免疫的可以用正常动物组织包板检测。

其检测方法同上，注意设立对照组。

同时对筛选的特异性较强的阳性孔转至24孔培养板中扩大培养，准备克隆化。

四、阳性细胞的转孔1、为保证转孔成功，建议当96孔板细胞长至80%时转孔。

2、按常规方法转孔前一天制备饲养细胞，24孔板每孔加入0.5-1ml 的饲养细胞悬液，第二天检查有无污染情况。

（转孔时所用培养基和转孔前所用培养基应保持一致）。

3、收集待转孔的阳性细胞上清，做好标记保存备用，添加已预热的HA T和HT培养基1:1混合（因此时96孔板克隆已半量过度到HT 培养基）各100ul/孔。

4、用200ul移液器轻轻吹下细胞，为减少对克隆细胞的刺激，吹打过程应轻柔，然后将细胞悬液加入至24孔板中，为保证细胞均匀分布到板底，可以用振荡器轻轻混匀，做好标记。

同时，对所转孔细胞补加新的培养基，保留原始孔以避免转孔失败。

五、转孔后的检测当转孔后细胞长至50%时，用ELISA检测方法及时进行效价检测和特异性检测，检测方法同上，筛选出效价高和特异性较强的准备亚克隆。

同时在筛选过程中对24孔板的细胞逐步更换至1640完全培养基。

六、杂交瘤细胞的克隆为保证克隆细胞的活性和数量，建议当待克隆的细胞孔长至80%时进行有限稀释。

提前一天制备饲养细胞，收集待转孔细胞的培养上清保存备用，加入已预热1640不完全培养基1ml（其目的是该孔细胞被有限稀释后可以冻存该孔细胞。

冻存方法为：直接吸取500 ul 该孔细胞悬液，再加入400 ul胎牛血清和100 ul DMSO混匀，1ml/管，做好标记，按照正常程序冻存细胞），轻轻吹打混匀细胞，取出少许细胞悬液进行计数，采用有限稀释法对阳性孔的融合细胞进行克隆化。

其步骤如下：1、用10ul台盼蓝和10ul细胞悬液于PCR管中等比例混合后，在显微镜下进行活细胞计数根据公式：细胞数/mL = N/4 ×103×10×稀释倍数（N为显微镜下四角4个大方格的活细胞总数）来计算每毫升细胞悬液所含的活细胞数，然后取适量的细胞悬液，用1640培养基（此时24孔板克隆细胞过度到那种培养基就用那种培养基做有限稀释）稀释到10mL，并且要含有2×103个活细胞（稀释度Ⅰ）；2、取1mL稀释度Ⅰ的细胞悬液加9mL1640完全培养基（稀释度Ⅱ）；3、取3mL稀释度Ⅱ的细胞悬液加7mL1640完全培养基（稀释度Ⅲ）；4、用稀释度Ⅰ的细胞悬液铺板半块96孔板，100µL/孔，20个细胞/孔；用稀释度Ⅱ的细胞悬液铺板另半块96孔板，100µL/孔，2个细胞/孔；用稀释度Ⅲ的细胞悬液铺一块96孔板，100µL/孔，0.6个细胞/孔；5、将上述培养板置于CO2培养箱中培养，培养7d后，对单克隆孔进行标记并半量换液，当单克隆长至孔底的1/10时，进行效价检测和特异性检测，筛选出特异性较高和阳性较强的细胞进行重复克隆；6、同时每次将克隆剩余细胞转入24孔细胞培养板培养（并在原孔中补加另一批培养基，以防二者同时污染或细胞死亡），继而转入6孔板或细胞中进行扩大培养，并及时冻存；经过多次克隆操作，直至所有克隆的细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，及时进行扩大培养并冻存。