微生物限度检验方法（一）
通常微生物限度检验的方法有平皿法、培养基稀 释法、薄膜过滤法等。 1.平皿法 根据菌数报告法规则取相应稀释级的供试液 1ml， 置直径 90mm 的无菌平皿中，注入 15～20ml 温 度不超过 45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰 红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养 基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养 基至少制备 2 个平板。
微生物限度检验方法（二）
2. 稀释法：取规定量的供试液，加至较大量的 培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不 具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml供物限度检验方法（三）
3.薄膜过滤法 采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于 0.45μm， 直径一般为 50mm， 若采用其它直径的滤膜， 冲洗量应进行相应的调整。滤器及滤膜使用前应 采用适宜的方法灭菌。 使用时， 应保证滤膜在 过滤前后的完整性。
洁净实验室内的温度应控制在18-26℃，相 对湿度最好在40%-60%。 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁 净度不低于10000级，局部洁净度为100级。 操作间或净化工作台的洁净空气应保持对 环境形成正压，不低于10Pa，操作间与缓 冲间应保持相对正压，不低于5Pa。
常用仪器使用注意事项（一）
检定菌管理（一）
人员要求：菌种设双人、双锁保管。用受过专业 培训，有足够的菌种保存经验。 检定菌的申购：根据检验品种的需要，菌种保管 员现提出购买检定菌的申请，并写明购买菌种名 称、标准编号、数量，注明要求购回时间，并交 QC主管、品管部经历批准。 检定菌的接收：菌种保管员应详细核对购买回菌 种与申购单中内容一致后，方可签字接收，并填 写《阳性菌购置记录》。
微生物实验室管理（二）
带菌的实验用品应浸泡在消毒液内48小时后取出， 或121℃，30分钟高压灭菌后进行洗涤。废弃带 菌培养物应121℃，30分钟高压灭菌后再行处理。 微生物限度检验室：生物限度检验室每周进行清 洁消毒并填写《微生物限度检验室清洁记录》。 消毒剂为0.1％新洁尔灭溶液或84消毒液，每月 轮换使用，清洁工具与其他区域的清洁工具严格 分开。每次操作前用消毒液或酒精棉球擦拭工作 面及一些可能污染的死角。用紫外灯杀菌至少30 分钟，并填写《紫外灯使用记录》。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润 湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前 应充分干燥。供试液经薄膜过滤后， 若需要用冲 洗液冲洗滤膜， 每张滤膜每次冲洗量为100ml。 总冲洗量不得超过1000ml。
计数方法的验证 （一）
验证方法 验证试验分4组，至少应进行 3 次独 立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的 回收率。 （1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最 低稀释级供试液 1ml 和 50～100cfu 试验菌， 分 别注入平皿中， 立即倾注琼脂培养基， 每株试 验菌平行制备 2个平皿， 按平皿法测定其菌数。 薄膜过滤法计数时， 取规定量试验可能用的最低 稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗 液中加入 50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过 滤法测定其菌数。
微生物实验室管理（三）
洁净实验室的要求： 室内墙壁光滑，应尽量避免死角，以便于 洗刷消毒。 应保持密闭、防尘、洁净、干燥。进行操 作时尽量避免走动。 室内设备简单，禁止放置杂物。 工作台、地面和墙壁可以用0.1％新洁尔灭 溶液或0.5％ 84消毒液擦洗消毒。
微生物实验室管理（三）
培养基管理
培养基的配置：按使用说明书上的要求操作。配置培养基 时用纯化水。填写配制记录。在每个已灭菌的培养基容器 外做好标记，注明名称、配制日期， 培养基的保存： 1环境条件：2～10℃为宜，不得冻结。 2保存时限：自配培养基应在2周内用完。 3琼脂平板最好现配，在冰箱内密闭保存不应超过一周。 4培养基的再融化：只允许再融化一次，45~50℃水浴中 保存不超过8小时。 5培养基的处理：被污染的培养基要经高温灭菌后在进行 处理。
培养箱：取放物品应快速进行，并随手关 闭箱门以维持恒温；定期检查加湿用水水 位，注意加水。每周要断电消毒一次。 超净工作台：在每次操作前后用消毒液擦 拭操作台及可能的死角，然后要打开层流 净化装置30min。操作者应穿着洁净工作服、 工作鞋、戴口罩。
常用仪器使用注意事项（二）
高压灭菌锅：每次使用前都要检查水位； 根据不同的物品选择相应的灭菌程序。当 屏幕显示“灭菌完成，可以开门”同时蜂 鸣器叫时，才可以开门取出物品。提篮不 可以超载，试管，玻璃瓶等的灭菌，应是 开口向下竖直放置。培养基灭菌时，装载 量不超过2/3容积，避免外溢。
微生物实验室管理（一）
发生菌液（或培养液）污染台面或地面时， 应立即以0.1％新洁尔灭溶液或其它消毒液 倾复其上，至少30分钟后再行洗擦 工作衣帽口罩等受到菌液污染时，应立即 脱去，高压灭菌后洗涤 如有传染性培养物污染手部，应先用酒精 棉球拭去，再浸入0.1％新洁尔灭溶内片刻， 再用肥皂及清水彻底洗刷干净。
检定菌管理（二）
检定菌的保存、传代： 1 菌种应于2～10℃专用冰箱中贮存，并有 每天的运行记录。 2 每月定期对菌种进行传代，传代时须核 对编号、代数、传代日期、所用培养基， 并记录。 3 控制传代次数。 一般传代次数不得超过5 代。
检定菌管理（三）
检定菌传代编号方法： 1 编号由阳性菌简写字母+代数+支数组成，中间以“—” 连接。 2 阳性菌的简写字母：大肠埃希菌：Y ，黑曲霉：H ，金 黄色葡萄球菌：JY，枯草芽孢杆菌：KY ，白色念珠菌： BY ，沙门菌：SY 3 保存形式： 在阳性菌的简写字母后加以汉子说明。保 存方式有两种，琼脂斜面保存和半固体加封石蜡，斜面保 存不用加以说明，如为半固体在阳性菌的简写字母后加写 “半”字。 4 首次购进的检定菌规定为0代，以购进时编号表示；第 一次传代后变为第一代，代数“1”，第二次传代后变为 第二代，代数“2”，依次类推。