我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。
细胞培养室实验操作规范一、细胞培养室的环境1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件：1) 培养室应为独立、封闭的空间。
培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入；2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上；3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒；4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。
5) 定期清理冰箱。
将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除；6) 培养箱要定期清洁。
隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份；7) 注意监测CO2的气压，及时补充。
8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。
2. 实验器具的清洗、消毒灭菌：1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。
*洗液：浓硫酸+重铬酸钾2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。
4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。
二、细胞培养用水、用液：1. 胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿；2. 平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca++、Mg++离子的要避免其沉淀。
可过滤灭菌或高压灭菌。
采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10分钟及即可。
灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。
3. 培养液的配制，以配制1000ml RPMI1640为例：1) 将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解；2) 加入5.94g HEPES，在磁力搅拌器上搅拌约半小时；3) 加入2g NaHCO3，继续搅拌约2小时；4) 定容至1000ml；必要时用1N NaOH凋至PH7.05) 过滤除菌。
滤纸由上到下为：普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜；6) 加入抗生素液至每毫升100单位青霉素+100μg链霉素；7) 按需要加入一定比例的血清使用。
常用10%胎牛血清。
8) 密封置于4℃冰箱保存。
超过一个月需补加谷胺酰胺（Gln）。
4. 消化液的配制：实验室采用0.125%胰蛋白酶溶液+0.01%EDTA1) 按0.25%的浓度计算所需的胰蛋白酶量，将称好的胰蛋白酶粉末置于烧杯中，用少许消毒的PBS液（或D-Hank液）调成糊状，再补足盐溶液；2) 搅拌均匀，置于4℃冰箱中一到两天，并不时搅拌振荡；3) 过滤除菌，分装成小瓶，置于-20℃冰箱；4) 按0.02%的浓度计算并称量EDTA，溶解；5) 高压蒸气灭菌，分装成小瓶；4℃冰箱保存；6) 使用时将胰蛋白溶液与EDTA溶液按1:1混合，混合液也可分装成小瓶，保存于-20℃。
5. 冻存液的配制：FBS+10%DMSO，可于4℃冰箱保存。
6. 抗生素液的配制：将青霉素及链霉素用三蒸水溶解，分别配成20万单位/ml及20万μg/ml，再按1：1混合，即为10万单位/ml青霉素+10万μg/ml链霉素。
可于-20℃保存。
使用时按1ml培养基加入1μl抗生素液的比例使用。
三、细胞培养实验基本操作1. 细胞的复苏非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏：1) 实验准备：将水浴箱温度调至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；2) 在记录本上查到所要复苏的细胞存于液氮罐中的位置；3) 从液氮罐中取出所要细胞，立即置于37℃水浴箱中，使其快速解冻；4) 将冻存管及培养液瓶的外表面用70%酒精擦拭后，入放入超净台；5) 将细胞悬液移到离心管中，并加入2-3ml培养基，用吸管轻轻吹打；6) 1000～1500rpm离心3分钟；7) 吸去上清液，加入2-3ml培养液，吹打均匀，使细胞悬浮；8) 将细胞悬液移到50ml培养瓶中，补加约5-8ml培养液；置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。
2. 细胞的传代培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
1) 悬浮细胞的传代悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。
当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。
然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。
2) 贴壁细胞的传代(1) 将消化液从冰箱中拿出，37℃解冻、预热；(2) 吸出全部培养液，沿壁缓缓加入消化液，将培养瓶有细胞面向下，加入消化液的量至刚好可以覆盖为止，轻轻摇晃；(3) 置于37℃消化2-5分钟，其间在显微镜下观察，消化至细胞收缩变圆、部分脱落即可停止消化，以防消化过度；(4) 加入两到三吸管含血清的培养液，终止消化；用吸管轻轻吹洗培养瓶有细胞的一面，以使细胞脱落干净；(5) 细胞悬液转移至离心管内，1000～1500rpm离心3分钟；弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
3. 细胞的冻存细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。
1) 贴壁细胞经消化、离心收集，悬浮细胞经离心收集；2) 大约106个细胞加入1ml冻存液，用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；3) 加入到冻存管中。
如用1.8ml的冻存管，每管最好不要加入超过1.5ml的细胞悬液；4) 在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；5) 用厚布或卫生纸包裹冻存管，置于4℃半小时，然后置于-20℃两小时，再置于-40℃两小时，然后置于液氮上方过夜；第二天将细胞置于液氮中；6) 记下冻存管存放的位置，作好冻存记录。
4. MTT法测药物的IC501) 将细胞接种于96孔板上，密度为大约105个/ml，每孔接种100μl；2) 培养至对数生长期加入待测样品；3) 作用48小时之后，加入三蒸水配制的5μg/ml的MTT溶液，每孔20μl；4) 37℃温育4小时；5) 取出培养板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀；如果是悬浮细胞则用板离心机离心后除去上清；6) 每孔加入100μl的DMSO，振荡5分钟以使沉淀溶解；7) 用酶联免疫检测仪在490nm处测出OD值；8) 求出各药物浓度下的OD值占对照OD值的百分比，用此百分比对药物浓度作图；在所得的曲线上，百分比值为50时所对应的浓度就是IC50值。
四、贵重仪器的使用说明1. 倒置荧光显微镜1) 普通光下，可作为相差显微镜使用；2) 在使用紫外光源时，可对发荧光的物质，或荧光染色的物质进行观察；3) 目镜为10×，物镜配有20×和40×两种，因此最大放大倍数为400倍；4) 配有三个滤光镜，波长分别为340-380nm，450-490nm，515-560nm，可按需要选择所需的激发光波长；5) 配备自动摄影系统；6) 使用时注意清洁，要严格防止样品触到镜头，防止样品中的液体沾到放样台及镜头上；7) 调焦时勿用力过猛，先粗调，后微调；8) 若使用时间很长，则应中间适当关闭休息。
若内部过热，光源会自动关闭，此时应耐心等待；9) 勿用手触摸镜头及滤光镜的玻璃面，发现镜头或滤光镜上有污点应用镜头纸擦拭。
2. 酶联免疫检测仪1) 打开电源，接好打印机；2) 在主菜单中选DEFINE项，进行检测程序的设置；3) 选择METHOD项，设置被检的板的大小（可在6孔、24孔及96孔板上检测），及检测用的光波长（配有五个滤光镜，波长分别为：405nm，450nm，490nm，570nm及630nm）；4) 再选择MAP项，按需要设置样品数量、重复数、对照等；5) 回到主菜单，选择READ项，进行检测。
超净工作台的使用超净工作台是细胞培养不可缺少的无菌操作装置。
净化台（超净工作台）的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。
风速为0.32米/秒，处理40分钟，工作台内即可形成高洁净的工作环境。
工作台侧面配有紫外线杀菌灯，可杀死操作区台面的微生物。
超净台按气流方向的不同大致有2种类型：1. 侧流式：净化的气流从左侧或右侧通过工作台面，流向对侧，也有从上往下或从下往上流向对侧流动，它们都能形成气流屏障面保持台面无菌，它的缺点是：在净化气流和外边气体交界处，可因气流的流动出现负压，使少量的未净化气体混入，而造成污染。
2. 外流式：气流是面向操作人员的方向流动，从而保证外面的气体不能混入。
它的缺点是：在进行有害物质实验时，对操作人员不利，但可采用有机玻璃把上半部遮挡起来，使气流经下方流出。
l 净化台使用注意事项：1. 净化台宜安置在清洁房间（无菌室）内，尘土过多易致滤器阴塞，降低其净化作用，并影响高效滤器寿命。
2. 根据净化台周围环境的洁净程度，定期（2-3个月）将粗涤纶滤布清洗或更换。
3. 定期（一般1周）对环境进行清扫和灭菌工作。
经常用沾有酒精或丙酮等有机溶剂的纱布擦拭紫外线杀菌灯表面，保持其表面清洁，否则影响杀菌效果。
4. 净化台工作时，平均风速保持在0.32-0.48米/秒之间，电压调在100V处。
风速出厂前已调节好，不要随意转动调压器旋钮。
若酒精灯火焰不动，说明风速未达到要求，加大电压后风速达不到0.32米/秒时，必须更换高效过滤器。
5. 使用前，超净台开紫外杀菌灯照射15-20min，可把操作过程中所需要使用的一些器材放进去一同照紫外。