2、无菌操作要求
操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后， 都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。 3、材料的切取和接种
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4、接种注意事项 ①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分 数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒 精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种. ②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体 数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4 块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分 利用培养基中的营养成分和光照条件. ③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖 基部插入培养基利于吸收水分和养分.
3、植物组织培养过程:
植物细胞培养 离 体 愈 脱分化 组 伤 再分化 织 组 或 细胞分裂素 织 ≈生长素 细胞分裂素 细 <生长素 胞 细胞分裂素> 生长素 芽 根
植 物 体
不需要光?
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需要光
植物组织培养的过程
离体的植 物组织或 细胞
脱分化
愈伤组织
再分化
根和芽
完整的植 物体
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珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、 透性好，适合栽培.
3、移栽 幼苗长壮后，移栽到土壤中. （六）栽培 幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情 况，适时浇水、施肥，直至开花.
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三、课题延伸 1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也 容易进行组织培养.
2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季.
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本课题内容小结
细胞分化 植物体的 组织培养 细胞全能性 组织培养过程 营养 影响组织培 养的因素 激素 环境条件
基础知识
菊花 组织 培养
实验操作
MS固体培养基制备 外植体消毒 接种 培养 移栽
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栽培
作业：P36
1、在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒、 灭菌，并且要求无菌操作。
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二、实验操作
（一）制备MS固体培养基 MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般 使用4。C保存配制好的培养基母液来制备. 1、配置各种母液
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①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓 缩100倍，常温保存.

②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一 般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液.
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③特点： A.持久性： 是一种持久性的变化，它发生在生物体的 整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度. B.稳定性： 细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的. C.全能性： 已分化的细胞，仍具有发育的潜能.
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④结果： 形成不同的细胞和组织
⑤原因： 基因在特定的时间和空间条件下的选 择性表达的结果. （2）细胞的全能性
课题1 菊花的组织培养
组织培养是指在人工培养基上，离体培养植物的器官、组织、细胞 和原生质体，并使其生长、增殖、分化以及再生植株的技术。
一、基础知识
1、植物的组织培养 （1）细胞的分化
①概念： 在个体发育中，相同细胞的后代在形态、 结构、生理功能上发生稳定性差异的过 程 . ②过程： 如：受精卵增殖、生长、分化形成组 织、器官、系统.
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（2）离体的植物组织和细胞对营养、环境等条 件的要求相对特殊，需配置不同的培养基 MS培养基主要成分包括： A、大量元素: N、P、 S 、 K、Ca、Mg等 B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、 Co等 C、有机物、植物激素
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MS固体培养基成分及比例
③用母液配制培养基时，需要根据各种母液 的浓缩倍数，计算用量.
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2、配置培养基 ① 配制培养液 ② 调PH ③培养基的分装 分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml. 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此 不必添加植物激素.
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3、灭菌
分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸 汽灭菌.
③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对 植物细胞发育方向的影响 生长素 > 细胞分裂素： 有利于根的分化 生长素 < 细胞分裂素： 有利于芽的分化，抑 制根的分化 生长素 ＝ 细胞分裂素： 促进愈伤组织生长 （4）pH、温度、光照 pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每日 用日光灯照射12h. 点此播放教学视频
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2、愈伤组织的继代培养 继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同， 在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外 植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养 一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质 减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。 如果愈伤组织长到直径为1－1.5cm时，就可以进 行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养. 在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开， 让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为 绿色. 点此播放教学视频
（二）外植体消毒
1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝. 2、消毒 ①流水冲洗 菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷 轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右.
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② 酒精处理 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体 积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－ 7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗.
①定义： 生物体的细胞具有使后代细胞形成完整 个体的潜能的特性. ②原理： 生物体的每一个细胞都包含有该物种所 特有的全套遗传物质，都有发育成为完 整个体所必需的全部基因.
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③实例 已分化的植物细胞，仍具有全能性. 高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能 性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性， 这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的 遗传物质. ④全能性的比较: 受精卵>生殖细胞>体细胞
答案：（1）离体的植物组织或器官 植物细胞具有全能性 （2） 愈伤组织 低 高 （3）③ （4）单倍体植株 秋水仙素 纯合 体 单倍体育种 （5）绿色 含有表达叶绿体的基因 （6）②
4、植物组织培养的应用： (1)、培育无病毒植株 (2)、 培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗 烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料） (3)、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能 力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种 子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子 困难或发芽率低等问题. (4)、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法
微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养 不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐 混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素 点此播放教学视频 两大类。
（3）植物激素的影响 ①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉 素 生长素类： 2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲 哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲 哚丁酸（IBA）
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（3）植物组织培养 细胞离体 ①必要条件： 一定的营养物质、激素和其他 外界条件 ②原理: 细胞的全能性
③相关概念: A.外植体：从活植物体上切下进行培养的那 部分细胞、组织或器官.
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B.脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细 胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。 C.再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中 重新分化根或芽等器官的过程 D.愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液 泡化的、成无定形状态的薄壁细胞.
植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养 条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于 某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养 物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此 要进行严格的无菌操作。 2、在选取菊花茎段是，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？ 外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。 生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。
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思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实 验吗？
答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。 设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养 基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养， 用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。
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（四）培养 1、愈伤组织的培养 从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2 周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白 色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温 箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈 伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽， 必须更换培养基，进行继代培养.
讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题 2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方 有哪些明显的不同？
答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必 需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持培养 基的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了 满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响 后所产生的特殊营养需求。
③消毒液处理
取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放 入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取 出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液.
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（三）接种 1、接种室消毒 污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种 室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空 气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外 线照射20分钟
细胞分裂素类：激动素（KT）、6－苄基嘌呤 （ 6－BA）、玉米素（ZT） 赤霉素类： 赤霉酸（ GA3） 点此播放教学视频
②生长素和细胞分裂素作用 植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、 脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在 的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势 使用顺序 先使用生长素，后使用 细胞分裂素 先使用细胞分裂素后使 用生长素 同时使用 实验结果 有利于细胞分裂，但不 利分化 细胞既分裂也分化 分化频率高