吸附色谱分离
是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂） 是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 有氧化铝 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 新的吸附色谱技术有： 新的吸附色谱技术有：
色谱分离的分类
1. 按分离机理不同分类
吸附色谱分离（ Chromatography，AC） 吸附色谱分离（Adsorption Chromatography，AC） 分配色谱（ Chromatography，DC） 分配色谱（Distribution Chromatography，DC） 离子交换色谱（ Chromatography，IEC） 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC） 凝胶色谱（ Chromatography，GC） 凝胶色谱（Gel Chromatography，GC） 亲合色谱（ Chromatography，AFC） 亲合色谱（Affinity Chromatography，AFC）
纯化蛋白的设备和生产成本相当昂贵，以致在 基因工程生产治疗蛋白的生产总成本中，分离和 纯化要占70%～90%。 色谱所分离出的杂蛋白的种类和数量要比传统 的方法多的多，这类蛋白可能有热源、病毒、 DNA和RNA、不准确转化的蛋白、糖化或氧化 产物、聚集体和与目标产品有类似构象的异构体 等，以及某些蛋白的复性工序所带入的新杂质。
凝胶色谱
以凝胶为固定相， 以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子 大小不同而进行分离的色谱技术， 大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子 筛色谱（ Chromatography， 筛色谱（Molecular Sieve Chromatography， MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（ ）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱 MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）。 Chromatography，SEC）
第三节 色谱条件及色谱纯化工艺的最优化
这是一项涉及学科面广，与色谱和现代分离科学乃至基 础理论密切相关的一门复杂的学问。 单纯从每一步和色谱分离最优化条件来讲，它涉及固定 相（包括种类、颗粒和孔径大小）、流动相、柱尺寸、流 速、洗脱方式、质量回收率和活性回收率等每一种参数的 最优化选择 接着便是将这些参数综合在一起的色谱条件最优化研究。 最后，便是将各步分离纯化串在一起组成一个完整的蛋 白纯化工艺。有时甚至连同发酵工艺一起来进行生产工艺 的优化选择。
色谱分类(按照进样量) 色谱分类(按照进样量)
1、分析色谱（10mg） 分析色谱（10mg） 中等规模制备色谱或半制备色谱（10-50mg） 2、中等规模制备色谱或半制备色谱（10-50mg） 制备色谱（0.1-1g） 3、制备色谱（0.1-1g） 工业生产规模色谱（大于20g/d 20g/d） 4、工业生产规模色谱（大于20g/d）
该法的复性机理为：
在变性蛋白进入柱顶端时，因有高浓度变性 剂的存在，变性蛋白质分子有一个随机的构象状 态和大的动力学水和半径，不能进入柱的空隙， 蛋白质在SEC柱上不保留。当受到复性的缓冲溶 液洗脱时，因其逐步取代变性剂并使蛋白质浓度 降低，使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高 能状态，这些蛋白质分子就会自发地向热力学稳 定的低能态-即蛋白质的天然状态转化，从而使变 性蛋白质开始复性。
定义溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速 定义溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速 度时， 度时，溶质在色谱柱上迁移的距离称之为有效迁移 距离，也称为有效柱长 有效柱长。 距离，也称为有效柱长。
其它色谱条件相同的条件下，有效迁移距离L 其它色谱条件相同的条件下，有效迁移距离Leff 是 随溶质的不同而变化的，对同一种溶质而言， 值 随溶质的不同而变化的，对同一种溶质而言，k1’值 愈小，其对应的L 就愈小， 愈小，其对应的Leff就愈小，洗脱所需时间也就愈 反之，洗脱所需时间就愈长。 短，反之，洗脱所需时间就愈长。 为使溶质迁移速度U 时的瞬时容量因子值） （k1’为使溶质迁移速度Ux=0时的瞬时容量因子值） 为使溶质迁移速度 =0时的瞬时容量因子值 最短柱长的定义为混合溶质中， 最短柱长的定义为混合溶质中，使一对最难分离 的定义为混合溶质中 的溶质的分离度R =1时所需的最短柱长 时所需的最短柱长。 的溶质的分离度RS=1时所需的最短柱长。
第七章 生物大分子的色谱分离 和纯化
分离方法
从现在分离科学理论计算得出，色谱和电泳是 目前所知最好的两种分离方法，其理论塔板数可 达百万数量级。 但是，因受各种因素的限制，电泳目前尚不能 用于生产规模的生物大分子的分离纯化，这就是 人们把分离和纯化生物大分子（包括蛋白质、酶、 核酸和多糖等，以下简称蛋白）的研究重点放在 色谱上的原因。
在色谱单元纯化条件的最优化中，首先 首先 解决的问题是要对所用色谱柱的种类进行选 解决的问题 择，这取决于试样和目标产物的性质。一般 来说，期望目标产品尽可能多的保留，而杂 蛋白不保留，因此需选择目标产品与固定相 作用力强、廉价的色谱柱。
1、选择填料 2、填料颗粒、孔径及柱尺寸的大小。 3、流动相 4、流动相组成、流速和梯度洗脱方式 5、选定几种不同色谱的最优化条件，将这 些单元进行组合以得到最佳分离和纯化工艺。
凝胶
是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结 构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。 构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。 当混合物随流动相流经凝胶柱时， 当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子不能进 入所有的凝胶网孔而受到排阻， 入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起 首先流出，较小的分子能进入部分凝胶网孔， 首先流出，较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的 速度较慢，更小的分子能进入全部凝胶网孔， 速度较慢，更小的分子能进入全部凝胶网孔，而最后 从凝胶柱中流出。 从凝胶柱中流出。 凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。 凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。
二、有效柱长和最短柱长
液相色谱（LC）分离小分子溶质时， 液相色谱（LC）分离小分子溶质时，从理论上 讲，色谱柱愈长，分离效果愈好，但因其长度受 色谱柱愈长，分离效果愈好， 到色谱仪提供的压力的限制， 到色谱仪提供的压力的限制，色谱柱不可能无限 度长。在实际应用中， 度长。在实际应用中，一般认为色谱柱的长径比 10，是色谱柱较为合适的几何比例。 为10，是色谱柱较为合适的几何比例。 生物大分子而言，它的保留主要是流动相中， 生物大分子而言，它的保留主要是流动相中， 置换剂的浓度决定的， 置换剂的浓度决定的，柱长对生物大分子的分离 几乎没有影响， 几乎没有影响，有时甚至会出现短柱比长柱分离 效果还好的情况。 效果还好的情况。
第一节 基本理论
一、计量置换保留理论
(1)溶质计量置换吸附理论。
它的核心是，当一个溶质被吸附剂吸附时， 在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一 定数目的溶剂分子。
（2）计量置换保留理论
计量置换保留理论
Lgk’ =lgI-Zlg[D]-------------简化数学表达式 Lgk =lgI-Zlg[D]-------简化数学表达式 （基于在色谱体系中溶质、流动相和固定 基于在色谱体系中溶质、 相分子间的相互作用） 相分子间的相互作用）
色谱分离的基本原理
在色谱操作中， 在色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操 作称为展开（Development）， 作称为展开（Development）， 洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱（Eluate）， 洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱（Eluate）， 而展开后各组分的分布情况称为色谱 （Chromatography）。 Chromatography）。
色谱分离（Chromatographic Resolution，CR） 色谱分离（ Resolution，CR）
利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如吸 利用多组分混合物中各组分物理化学性质（ 附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、 附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、分 配系数等）的差别， 配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定 相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时， 相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由 于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动， 于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动， 使之分离。 使之分离。
不同溶质在其迁移速度大于零， 不同溶质在其迁移速度大于零，但小于流动相的 线性流速时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献， 线性流速时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献， 此时溶质迁移所经历的柱长对分离有贡献。 此时溶质迁移所经历的柱长对分离有贡献。
而当其迁移速度等于流动相速度时（ 而当其迁移速度等于流动相速度时（即固定相不 吸附溶质或溶质完全从固定相洗脱时） 吸附溶质或溶质完全从固定相洗脱时），溶质迁移 所经历的柱长对分离无贡献。 所经历的柱长对分离无贡献。
1、进样后可很快除去变性剂 2、色谱对于蛋白质分子的吸附，提高了复性的质量 色谱对于蛋白质分子的吸附， 和回收率 3、复性同时达到纯化目的 4、便于回收变性剂，以降低废水处理成本 便于回收变性剂，
SEC-----空间排阻色谱或尺寸排 1 、 SEC--- 空间排阻色谱或尺寸排 阻 色 谱 （ Size Exclusion Chromatography） Chromatography）
优点
①分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数； 分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数； ②应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、 应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、 小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质， 小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及 热稳定到热不稳定的化合物， 热稳定到热不稳定的化合物，尤其是对生物大分子样 品的分离，是其他方法无法代替的； 品的分离，是其他方法无法代替的； ③选择性强； 选择性强； 高灵敏度的在线检测， ④高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器 进行连续的在线检测； 进行连续的在线检测； 快速分离； ⑤快速分离； 过程自动化操作。 ⑥过程自动化操作。