安捷伦GCMS内标法定量简介（以5975为例）一、内标法基础回顾（包括外标法的概念）1. 定量响应值不同的物质，由于其物理性质，化学性质（化学结构）的不同，在气相色谱检测器（FID，TCD，FPD，ECD，MSD等）上的响应会不同。
相同量的同种物质对不同检测器响应不同。
相同量的不同物质对于同一种检测器响应不同。
在质量选择检测器（MSD）上，物质的化学结构不同，电离电位不同，需要的电离能量不同，裂解碎片不同，裂解碎片丰度不同，这样得到的质量离子色谱图的峰面积或峰高也不同（当然总离子色谱图的峰面积也不同）。
直接用响应信号定量，必然导致较大误差。
故引入响应因子或校正因子。
定量响应因子或校正因子对检测器产生的信号加以校正，校正后的峰面积可以定量的代表物质的含量。
例如图1中A, B, C 三个化合物的有不同的含量和峰面积。
图 1响应值S，即为某一物质（组分）在检测器所产生的信号强度（电信号，峰高，峰面积等，本篇均采用峰面积为例，包括下面的校正因子计算，内标法计算等），例如一定质量（m）的某一物质通过检测器在工作站或积分仪上产生峰面积为A，则可用下式表示：绝对响应值S’ i = A i / m i(式中：m i -----i组分的量；S’i -----i组分的校正因子；A i----i组分的峰面积)绝对响应值S就是单位量物质通过检测器时产生的信号强度（电信号，峰高，峰面积等），也成为绝对灵敏度。
一个化合物的绝对响应值就是该化合物的含量除分析这个校正混合物时该化合物的峰面积（或峰高）的值。
绝对响应值校正了检测器对不同化合物的响应能力。
当校正样和未知样品在同样的条件下分析时，外标法是基本的定量方法。
未知样品的结果与校正样的结果相比较从而计算出未知物的含量。
外标法使用绝对响应。
响应因子从校正表中得到并可储存。
在分析后面的样品时，响应因子被用于计算化合物的含量。
使用这种计算方法必须注意一点，即每次运行的进样量必须是一致的。
或者讲每一组分的检测面积除以其已知的含量得到各自的响应值。
例如图1中A化合物的绝对响应值S’ A=3000(假如单位为pA*sce)/100(假如单位为ng或ppm)=30B化合物的绝对响应值S’ B=2500/80=31.25C化合物的绝对响应值S’ C=4000/200=20组分的面积乘以响应值得到其含量（或浓度）, 即外标法：m i = A i S’ i m i = A i/S’ i外标法优点是：快速简单, 只要待测组分出峰且完全分离即可。
但要求：进样量、色谱质谱分析操作条件严格不变。
是属于绝对法。
绝对响应值的使用也是要求进样量、色谱质谱分析操作条件严格不变。
所以引入相对响应值，用于内标法的计算（进样量，操作条件没有外标法那样严格要求，是相对测定法，下面会谈到）。
化合物i的绝对响应值为S’ i = A i / m i化合物s(基准物或内标物)的绝对响应值为S’s = A s / m s则化合物i对于内标物s的相对响应值：S i/s= S’ i/S’s = A i m s /（A s m i）(或者讲内标物的相对响应值等于1)例如图1中，假如化合物B为基准物（或内标物），则相对于B，化合物A的相对响应值是：S A/s = 3000*80/(2500*100) = 0.96 或 S A/s = 30/31.25 = 0.962. 定量校正因子校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。
可用下式表示：绝对质量（或重量）校正因子f’i = m i/A i可以导出 m i = f’i A i式中：m i -----i组分的量；f’i -----i组分的校正因子；A i----i组分的峰面积例如图1中A化合物的绝对质量校正因子f’A = m A/A A = 100/3000 = 0.033(与组分性质、仪器灵敏度等有关，例如外标法采用绝对质量校正因子进行计算)相对质量校正因子 f i/s= f’i/f’s = m i A s/(m s A i)例如图1中，假如化合物B为基准物（或内标物），则相对于B，化合物A的相对校正因子是：f A/s = 2500*100/(3000*80) = 1.04响应值和校正因子的关系是互为倒数：即 S = 1/f 或 f =1//S 或Sf=1。
实际上一般多采用校正因子来进行定量计算。
注：安捷伦的仪器使用绝对响应因子（用RF表示）进行外标法定量，别的仪器是绝对校正因子。
实际上安捷伦的RF就是一般的校正因子。
3. 内标法简单的讲，内标法就是在待测的样品中准确加入一定量的内标物，根据被测物和内标物的量及其在（在质谱中是质量色谱图）色谱图相应的峰面积比取出此被测定组分的含量。
样品中加入内标物，利用被测物与内标物校正因子的比值不变来进行定量的。
首先用被测物标准品和内标物配制标准溶液，求得定量响应因子或校正因子：S i/s= S’ i/S’s = A i m s /（A s m i）或 f i/s= f’i/f’s = m i A s/(m s A i)请参考上面的相对响应值和相对校正因子的例子。
在样品中准确加入内标物后，再由它和样品的峰面积来计算：m i =（A i /A s）*m s/ (S’ i/S’s)= （A i /A s）*m s /S i/s(在安捷伦上是m i =（A i /A s）*m s * RF‘i/s）或 m i =（A i /A s）*m s* f’i/f’s = （A i /A s）*m s * f i/s例如，在含未知物A，C的样品中加入100ppm*的内标物B，进样后得到图2的色谱图：（注：*例如，准确称取1.0000样品，加入1000ppm（即0.1%）的内标物化合物B 标准液0.1000g，即在样品中的内标含量为: 1000ppm*0.1000/1.0000 = 100ppm）图2则A化合物的含量为：m iA = （A A /A s）*m s * S A/s = 2900/2400*100/0.96 = 126 (pp m)或 m i =（A i /A s）*m s * f i/s =2900/2400*100*1.04 = 126 (ppm)内标法的优点：进样量不严格要求. 内标的加入消除了由于进样量、仪器不稳定等因素带来的系统误差。
只对欲分析的组分峰做校正内标法的缺点：每次需要准确称量内标物和样品。
必须加一个组分进到样品，有可能增加面积测量误差。
作为内标的化合物其化学性质和保留时间最好都应和目标化合物相似（理想状态）。
但它必须能按保留时间或 m / z 值来和样品区分。
同位素标记目标化合物是一个理想的内标物，它可以由其离子和目标化合物的M/ Z值区别开。
选择内标物的标准1.样品中不存在2.化学性质与样品相似3.与样品有相同的浓度范围4.不会与样品发生反应5.在感兴趣组分附近流出6.可得到分离良好的、干净利落的峰*7.色谱性质稳定8.可迅速容易得到*GC/MS对于第6项不要求。
如果有条件，运用同位素标记化合物做内标物，其化学性质、色谱特性等都与目标化合物一致，因此校正精度更高。
二、积分要准确定量，必须对色谱峰正确积分。
质谱工作站通过两种积分方式，即RTE 积分器（RTE Integrator）和化学工作站积分器(ChemStation Integrator)。
RTE 积分器对相对简单的色谱图（其中的峰很窄且已完全解析）提供了一种非常快速的积分。
尤其适用于 target compound analyses(目标化合物分析)。
缺省参数假设待积分的数据是在整个色谱图范围内使用毛细管色谱柱色谱仪扫描到的数据的总离子流 (TIC)。
如果选择适当的积分参数，则 RTE 积分器即可处理采集 (SIM) 和积分目标，如在较小的保留时间窗口中检测内标化合物。
化学工作站积分器可以满足各种类型色谱图的积分，包括那些带有难于处理的基线和负峰的色谱图。
通过设置积分参数（通常称作积分事件）可以控制积分过程。
根据需要，在数据分析（Data Analysis）的色谱（Chromatogram）菜单的Select Int egrator下面选择RTE或ChemStation积分。
在MS Signal Integration Parameters…设置积分参数。
我喜欢用ChemStation积分器。
处理各种各样的峰较为方便且积分准，直观，特别峰型复杂时。
但自动编辑定量时，用RTE较好。
有关两种积分方法的各项参数的意义及使用方法请参考工作站中有关内容。
这里就不罗嗦了。
总之，在编辑定量校正表，建立校正曲线，进行内标法计算时，要设置合理的积分参数，正确积分（必要时，采用手动积分）以得良好的结果。
三、建立内标定量数据库(单级校正)示例以演示数据文件 C:\MSDCHEM\1\DATA\EVALDEMO.D为例说明如何使用自动定量设置创建定量数据库。
调用(load)evaldemo.d质谱数据文件。
并选用合适的积分参数积分。
图3检索的结果为：图4这里假定四个化合物的含量如下：保留时间RT（min）化合物含量（ppm）5.28 十二烷（dodecane） 206.43 联苯 (diphenyl) （内标） 307.74 4-氯联苯 (4-chlorodiphenyl) 269.78 十六酸甲酯 (methyl palmitate) 23使用自动定量设置创建定量数据库，选择Calibate/AutoQuant Setup 图5图6如果使用RTE积分，就在Use RTEINT前面打钩。
如果选用ChemStation积分，则去掉√。
图7定量数据库全局参数 (Quantitation Database Globals) 窗口用来编辑在当前的分析中所有化合物的有关信息。
在这儿可以设置定量报告、峰位置、新化合物资料等参数。
这些参数设置是针对所有化合物的，但对某具体化合物可以改变设置。
Calibration Title（校准标题）：如果愿意输入一个标题（可选）。
这个标题将显示在每个定量报告的标题栏中。
Default Multiplier（缺省的乘数）：在打印报告前，所有未知样品定量计算结果乘以这一给定的乘数。
Default Sample Concentration（缺省的样品浓度）：在打印报告前对未知样品的计算结果要除以这个浓度再乘100。
在最后的报告中浓度单位换成％，输入 0 值说明在报告中样品浓度用绝对值表示而不是用百分数。
Reference Window / Non-Reference Window（参考峰窗口/非参考峰窗口）：用来确定在定量数据库中指定的峰是否在要处理的数据文件中，单位是％或分钟。
如果设定值是5% 表示要处理的峰其保留时间必须是在定量数据库中保留时间的 +/- 2. 5%之内。