SPR生物传感器研究综述刘小林(宜春学院,江西宜春336000) 摘　要:SPR生物传感器已广泛应用于易变反应物与传感器表面固定结合配体之间特定定性与定量分析1文章综述了这种新技术的研究和应用进展情况,传感器的组成和工作原理,传感器表面和固定,应用于实验的步骤,实验结果与未来发展趋势1关键词:SPR生物传感器;固定技术;生物大分子中图分类号:Q6　文献标识码:A　文章编号:1671-380X(2006)04-0120-04Rev i ews on the Study of Surface Pl a s m on Resonance B i osen sorsL I U Xiao-lin(Yichun College1J iangxi Y ichun336000China)Abstract:Surface p las mon res onance bi osens ors have become increasingly popular for the qualitative and quantitative characterizati on of the s pecific binding of a mobile reactant t o a binding partner i m mobilized on the sens or surface1This A rticle revie ws the study devel2 opments of this ne w technique,including sens or surface and i m mobilizati on,an app lied experi m ental p r ocedure,experi m ental results and future pers pectives1Key words:Surface Plas mon Res onance B i osens or;I m mobilizati on Technique;B i ol ogicalMacr omolecule 1990年,随着SPR生物传感器(Surface p las mon res o2 nance bi osens ors)的传播,可视的光波生物传感器随即被广泛应用并逐渐成为生物大分子间相互作用的定性和定量的检测工具1对照于其他方法,这种生物传感器能察觉到在流动时期结合到被固定在生物传感器表面的特殊反应1SPR 生物传感器部分地引起关注是因为被测的物理量是折射率变化,因此,没有chr omophoric组或被标记的生物大分子是必须要的1另外,SPR生物传感器在结合的过程中提供即时的消息,也适用于μM到sub---n M宽物质间的相互作用1目前,很多大分子间的相互作用在SPR生物传感器上的应用被公开地应用于多个领域1包括细胞粘附因子,T 细胞抗原受体和MHC-编码分子,受体—配体的相互作用,抗体抗原的相互作用,病毒研究,蛋白质—DNA和DNA--DNA间的相互作用,脂类泡状体或平面双层间的相互作用及与膜结合的单程转录复合物的合成等1除了由B iacore、Upp sala、s weden(B I A core)、I ntersents I nstru ments BV、Amersfoort、Netherlands(I B I S)制造的工业上应用的SPR生物传感器和几种用于装备实验室的SPR生物传感器外,目前只有两种渐消失的光波导耦合方式生物传感器在工业上被应用,这两种生物传感器(Kretsch mann结构为基础的棱镜型和衍射光栅型生物传感器)是以反射原理和光栅配体原理为基础,它们在描述可视物质的相互作用的性能上与SPR生物传感器类似1用渐消失的光波生物传感器得到的可靠的数据描述化学结合动力学和平衡点,比较于简单的结合定性分析,这是一种费时费力的工作1即便是反应都遵守简单的准一级动力学规律,需要克服的困难却有:(1)固定技术必须按本来的结构结合自由反应物,必须反应均匀,必须达到方位1表面不允许有较多的非特异性结合1(2)相对地小折射率的指标增加的大多数生物大分子必须有限制的集中于传感器表面的结合位点上1(3)自由反应物能有效地运输到反应的传感器表面等问题比混合反应物的问题难解决得多1结果,测量的结合过程曲线受到限制自由反应物的质量转移,和到达传感器表面和在传感器表面上毗邻结合位点的障碍,这些测量的结合过程曲线也同样受到固定反应物不同亚群结合过程重叠和非特异性结合的影响1最近几年,最重大的进展是实验技术的发展使这些问题可以得到解决或降低其影响,在计划上控制实验,在分析程序和诊断上的发展,在结果的描述上都有改进1SPR生物传感器的基本构造是一个由很薄的金属薄膜(通常是金的或银的)组成的棱镜,这个结构最早由Kretsch mann和Raether提出,光在棱镜内部的全部反射往往激发金属薄膜上的非放射性表面胞质团1这种胞质团是使金属薄膜表面产生等离子膜共振11　生物传感器的组成和工作原理第28卷　第4期2006年8月 宜春学院学报(自然科学)Journal of Yichun University(s ocial science)Aug128,No14Aug12006收稿日期:2006-04-17作者简介:刘小林(1966-),男,江西高安市人,副教授,在读博士研究生,研究方向:农学与生物技术1传感器是能将一种被测量的信号(参量)转换成为一种可输出信号的装置1生物传感器(bi osens ors)就是用生物成分作为感受器的传感器1通常由感受器和换能器和电子线路三部分组成1当待测物质通过具有分子识别功能的接受器时,固定在接受器上的亲和配基与待测生物分子相互作用的瞬间发生能量的转移,经过换能器,这种能量会以电或光等物理讯号的方式输出,经过电子系统的放大处理和显示,就可以测出待测物质的量1感受器是生物传感器的心脏,整个生物传感器核心技术也在于此1制备感受器包括两个方面的工作,一是选择最佳的载体材料,二是在载体表面固定化亲和配基1传感器另一个重要组成部分是换能器,它可以感知固定化配基(分子识别器)与待测物质特异性结合产生的微小变化,并把这种变化转变成其他可以记录的信号,如检测电学变化,密度和质量的变化,振幅和频率和声波相位的改变,或用热敏感元件测量热学的改变1把这些信号送到放大装置中,输出并记录结果1换能器质量的好坏,决定了传感器灵敏度的高低1SPR是一种物理光学现象,是电磁波所激励的在金属和电介质交界面上形成的影响电磁波传播的谐振波1表面等离子体(SP)是沿着金属和电介质间界面传播的电磁波形成的1当平行表面的偏振光以称之为表面等离子体共振角入射在界面上,发生衰减全反射时,入射光被耦合入表面等离子体内,光能大量被吸收1在这个角度上由于表面等离子体共振引起界面反射光显著减少1由于SPR对金属表面电介质的折射率非常敏感,不同电介质其表面等离子体共振角不同,同种电介质,其附在金属表面的量不同,则SPR的响应强度不同,基于这种原理的生物传感器通常将一种具特异识别属性的分子既配体固定于金属膜表面,监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程,在复合物形成或解离过程中,金属膜表面溶液的折射率发生变化,随即被SPR生物传感器检测出来12　传感器表面和固定SPR生物传感器不必为反应物贴标签,一种结合配体被固定在传感器表面(被看作是肉眼可见到的尺寸相当于标签)1结合亲和力和动力学的分析通常解释结合反应独有的反应物间本来的相互作用,那就是,非特异性表面结合是可以忽略的,固定也不影响结合位点的结构,更可取地是,大分子必须按相同的方位连接或自由的接近自由反应物1因此,传感器表面的固定技术的应用非常重要,有很多不同的固定技术已经被描述1显然,做好结合配体的固定是最佳的选择,并且最好固定技术的应用决定于特殊的相互作用的大分子,如果有可能,选择使用各种固定技术似乎有很多优点13　SPR生物传感器应用于实验的步骤第一、反应物要共价的结合到传感器表面,在实验的接合期,自由的第二反应物按结合浓度溶于缓冲液并在传感器表面流动,而传感器表面检测着过程中的复杂信息1接下来是解离期,自由的反应物不在缓冲液中并且记录复杂解离的时程,最后,传感器表面去掉剩余合成物而恢复[比如短时暴露在过低PH值的缓冲液中]1这些结合、解离、和再生循环在不同浓度的自由反应物中不断重复,所得到的结合过程曲线包括化学率常数与热力学平衡常数间相互影响的信息14　实验结果平衡衡量一般地允许数据遵从方程式6,在许多研究中,提取平衡不变告诉我们一对化学物质是独立的和选择结合对象是固定的,类似的结合过程曲线服从方程式4和7是常有地1然而,在大多数试验中,期望单个代表者联合和分离过程违反结合动力,取而代之,联合时期显然多数代表者或S型结合过程被观察,在分离时间,双代表者曲线是非常常见的,虽然,这可以指出多步骤结合机制或多价的影响,这些影响还是服从系统坚持简单的唯一级动力,因此,常有地偏差归因于固定结合位点上亚种的存在(本生存在的或不规则固定产生的)在传感器表面立体的妨碍的影响,或群体转移限制中外来物质的产生,这些在分离时期都牵涉重结合1尽管如此,大多数公开的实验都争论方程式4和7,为纯准一级结合,可正确的特有的选择数据子集,这可指示的接近可导致随意地和内部地不一致的结果,例如:比率K-/K+是不同的命令大小从平衡固定K D获得平衡平面信号,这些违反方程式1、消极的推断价值K ObS在f O=0;或服从结合率不变的在结合期K ObS比K-小,这违反方程式5,这主张获得动力率常数可翻译表面率常数,然而,这可指出清晰的数据不追随模型为起源率常数是基础,率常数的使用是一个问题1K D=K-/K+(1) d[XL]/dt=k+[L]([X]t ot-[XL])-k-[XL](2) dR/d t=k+f o R sat-(k+f o+k-)R,(3) R(t)=R eq(f o)[1-exp(-k0bs t)](4) K obs=k+f o+k-(5) R eq(f o)=R max[1+k-/(k+f o)]-1=R max[1+K D/f o]-1(6)R(t)=R(t o)exp[-k-(t-t0)](7) K+app/k+=k-app/k-=[1+k+(R sat-R)/k tr]-1(8) K li m obs(f o)=(k+・f o+k-)/[1+(k+R sat/k tr)(1+k+f o/ k-)-1](9) dR/dt=-k-R/[1+k+(R sat-R)/k tr](10)许多研究是比较其他实验室中有关大分子相互作用系统,用生物传感器获得的平衡常数和动力常数,在很多不同时期,例如热量测定法沉淀平衡,荧光猝灭,E L I S A,过滤结合测定,在有些实验,有些可限制实验不稳定的方法出现,在其他的研究中,最大的不同是显而易见的,包括许多序列大小的差异,N ieba和结合用生物传感器发现不同的半抗原对抗体相对吸引力能与E L I S A竞争实验中体现最大的不同点1当然,很难找到一般的规律,它们服从不一致和矛盾在重要的严密的数据分析和控制实验下划线,持这种看法第4期 刘小林:SPR生物传感器研究综述 第28卷即是Ladbury等人的研究的结果:即如果采取适当控制的话就可解释用SPR和用热量计得到的结果之间有些差异1同样地,分析结合动力的竞争实验决定平衡常数的研究的改变,N ieba等可解决E L I S A实验矛盾的结果1在随后的讨论中,在SPR生物传感器中人工效应物来源一起建立特征和数据分析技术被描述出来15　SPR生物传感器研究进展SPR生物传感器是一种研究生物分子相互作用的有用工具1这类传感器的一个突出优点是测量准确度高,此外,响应快,体积小,机械强度大,抗电磁干扰能力强和光纤相连可实现数据的远程采集和连续的在线监控120年前,人们首次用ATR技术激励SP W制作SPR传感器以来,SPR 传感器发展十分迅猛1从国内外近20年的研究成果上看,光学SPR传感器在结构上可分为:棱镜耦合式SPR传感器、集成光波导耦合式SPR传感器,光纤式SPR传感器和光栅耦合式SPR传感器1如果按照测量方式,则可分为角度指示型、波长指示型、光强指示型、相位指示型1集成光波导SPR传感器最早报道是在20世纪80年代1此后人们相继对平面波导型,沟道波导型甚至复合波导型做了研究,近年来,人们研究集成光波导SPR传感器时,大都采用宽带光源1光纤SPR传感器结构有2种形式,一种是传感器位置在光纤的中部,另一种的传感位置在光纤的一端1人们最初使用多模光纤制作1使用多模光纤有一个明显缺点,由于模间干扰的存在,导模和SPR之间的相互作用在强度上的变化难以确定1为了克服这一缺点,大多数情况下使用单模光纤1棱镜耦合式SPR传感器人们目前普通采用Kretsch mann结构,而很少采用ott o结构1目前这种传感器已从实验室走向市场1光栅型SPR传感器的研究报道最早出现是在1987年1相对于其他三种类型的SPR传感器来说,目前光栅型SPR研究报道显得很少,其原因是,除了在制作方面有一定难度外,在分析应用上也存在一定的问题1未来SPR传感器的研制和发展朝着以下几个方向开展:一是进一步提高检测准确度;二是开拓多信道传感器;三是研制先进的标识元素1四是器件微型化和阵列化;五是降低检测成本等16　SPR生物传感器应用进展自L iedberg等于1983年首次运用SPR技术进行抗原抗体相互作用分析以来,SPR生物传感器技术已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号传导、受体/配体,抗体/抗原分子垂钓、免疫识别、癌症研究和新药筛选等生命科学领域,用于实时和动态研究蛋白质—蛋白质,蛋白质—核酸、新药分子—靶蛋白等生物分子互作过程1特别是在1990年瑞典的B iacore AB公司开发出世界上第一台商业化的SPR生物传感器B iacore T M之后,商业化的SPR生物传感器已经从根本上改变了生物分子识别科学,成为生命科学和制药研究上的标准工具1此外在食品、环境科学、临床诊断,细胞膜模拟、基因测序、疾病治疗、案件侦破1兴奋剂检测等应用领域不断扩展1(1)在检测方面1主要应用于物理量检测、化学检测和生物检测1物理量检测上,主要利用SPR传感器技术进行检测的湿度传感系统及基于氢化无定型硅的热光效应的温度系统1化学检测上,主要利用SPR 传感器通过检测共振角或共振波长的变化来检测待测分子的成分、浓度及参与化学反应的特性1生物检测上,主要用于检测生物分子的结合作用或者通过生物分子结合作用的检测来完成特定生物分子的识别及其浓度的测定,如早期抗原-抗体的相互作用,strep tatividin和维生素H的相互作用及一些I gG的检测1近年来,还涉及到蛋白质之间或者蛋白质与DNA相互作用检测以及蛋白质结构变化的检测、抗瘤蛋白质APC的生物化学属性的检测、醣蛋白与单克隆抗体的动态反应过程的检测,还有细胞色素C、葡萄糖、机球素、铁蛋白、香烟中的烟碱,破伤风毒素、艾滋病毒等的检测等1近年来,还出现了利用SPR检测方法来监测酶促反应的动态过程1(2)药物筛选1SPR技术因其实时、高通量、特异性及能在天然状态下研究药物分子与靶点的相互作用,为新药研发提供了有力的工具1在药物筛选、药物分子靶点鉴定及先导药物化合物结构优化方面有着广泛的应用1当前发展中的药物筛选生物传感器测试包括两方面内容,一是从文库中筛选与靶蛋白结合的化合物;二是进行一般的ADM E(即吸附、分散、代谢、分泌)试验1此外应用SPR在体外研究肿瘤细胞中Ras癌基因的蛋白功能方面、在开发抗癌肽方面、在药物代谢研究方面均取得了重要的进展1(3)蛋白质组学1SPR技术因其高效灵敏无需额外标记等优势,广泛应用于蛋白质检测和蛋白—蛋白相互作用等蛋白质组学研究,它能在保持蛋白质无然状态的情况下实时提供靶蛋白的细胞器分布,结合动力学及浓度变化等功能信息,为蛋白质组研究开辟了全新的模式1如以生物分子互作/质谱结合技术(B I A/MS)为技术平台的蛋白研究系统为蛋白质组学研究提供了高效有力的工具,在亲和性配体垂钓、蛋白竟争性结合及蛋白结构研究中显示了独特的优势1(4)临床诊断1利用生物传感器鉴定和评价潜在的疫苗组分,监测和定量测定病人血清中的生物药剂和抗体滴度的可行性,跟踪检测动物模型,人类临床试验和多种台式应用中的生物反应物,(5)食物检测和环境监控1生物传感器已经应用于测定食物中营养物和抗生素的水平,食品中细菌和真菌污染量以及空气或水传播的毒素,杀虫剂和除草剂1生物传感器的在线分析能力和高灵敏度、微量样品需求的特点,使得这种仪器成为食品及环境安全监控的理想工具1(6)细胞膜模拟1生物传感器的金属表面能天然模拟细胞膜组分与可溶性分析物的相互作用1大量文献介绍了利用B iacore的疏水性HP A 或亲脂性L1传感器芯片构建杂交脂双层,进行膜模拟的研究工作,这些芯片表面的稳定性和可重复性使药物、抗体和蛋白结合到脂膜的定性和半定量分析成为可能1(7)遗传分析1SPR生物传感器用于遗传分析是一个崭新的领域1如用于检测点突变,用于检测区分野生的和经遗传修饰的大豆基因序列等1总之,随着生物传感器芯片技术、实验方法及数据分析技术的不断发展,SPR生物传感器的应用领域将不断扩大,技术水平及实用程度将不断提高,有着第4期 宜春学院学报(自然科学) 第28卷非常广阔的应用前景17　结论与未来展望生物分子之间的相互作用是生命现象发生的基础1研究生物分子之间的相互作用可以阐明生物反应的机理,揭示生命现象的本质1近年来,研究分子相互作用的技术不断出现,其中表面等离子体子共振(surface p las mon res o2 nance,SPR)在生物学以及相关领域的研究应用取得了很大进展1SPR技术可以现场、实时地测定生物分子间的相互作用而无需任何标记,可以连续监测吸附和解离过程,并可以进行多种成分相互作用的研究1SPR技术在免疫分析, DNA的复制和转录、DNA的修复,药物的筛选,蛋白质分子相互作用分析以及肽库和抗体库的筛选等生命科学领域的应用研究取得了令人瞩目的进展,显示了常规技术无法比拟的优越性1如今,SPR技术已被广泛地用来分析生物分子如蛋白质—蛋白质、药物—蛋白质、蛋白质—核酸、核酸—核酸之间相互作用的反应动力学、结合位点和反应物浓度等信息,所涉及的研究领域包括免疫识别、信号传导、药物筛选、抗体定性以及蛋白质构象变化等1SPR技术在分子生物学研究领域中应用的范围非常广,在研究基因工程载体与质粒DNA之间的相互作用,以评价载体效率、DNA序列特异性抗体的性质鉴定等方面,SPR技术都发挥了重要作用1 SPR技术与其他分析技术的联合应用,必将加速分子生物学的研究进展,使我们对生命现象的了解更加深入1 SPR的运用及关于生物传感器描述可视化的大分子相互作用的技术还年轻,但已应用于各个领域,如医学分析、环境监视、生物技术、药品品制造、食品加工、蛋白质组学、酶学、分子生物学等1另一方面,随着可获得的对平衡力学和动力学率恒定的定性分析的运用,很多判断潜在的人工效应物被确定1与此同时,一些不同的固定化学物质,实验性控制潜在的人工效应物和分析技术开发出来,同时,它们必须通过严密的测量动力率和平衡常数,或必须清晰地认出结合曲线和结合等温线偏差的来源,不幸的是,关于结合位点异质性的影响的分析或除去体积和群体转移限制的影响导致相反的结果,在推测不同部分的结合过程曲线中包含判断信息的生物结合反应物,另外,因为其错综影响不能做全球分析研究模式,因而,实验性控制是不可缺少的,不管测量结合过程曲线是否明显遵从1:1模式,例如:利用不同密度的固定反应物能诊断和同时将群体转移的影响降低和立体障碍的减少1然而,有关结合体积的不同相对高和统计错误在获得率常数上,同样的,明显的异质性结合位点被实验证明,例如,一对化学物质的转变或解答竟争实验1如果这些和那些破坏因素能包含基础的控制实验,全球分析研究能有效地保证内部的一致数据分析,能最综合指示复杂的反应计划,但是虽然解决动力率常数不可能,在生物领域里,信息较低的限制率常数会对自身有价值1尤其最特别的地方是开发利用平面传感器表面覆盖蛋白,如膜结合受体,给合进双分子载体,这构造提供侧面受体在双层分子上的移动和遵循大分子在生物膜上流动时相互作用的模式1总之,可视的渐消失光波生物传感器这一重要工具对可信赖的决定反应率和平衡常数的测定是可利用的1参考文献:[1]Ra m sden JJ,Bach manova GI,A rchakov A I1I m mobilizati on of p r oteins t o li p id bilayers[J]1B i osens ors B i oelectr on,1996, 11:523-281[2]Ra m sden JJ,Schneider P1M enbrane inserti on and antibody recogniti on of a glycosyphos phatidylinost ol-ancho-red p r otein: An op tical study[J]1B i ochem istry,1993,32:523-291[3]R iggs AD,Bourgeois S,Cohn M1The lac rep ress or-oper2 at or interacti on1III1Kinetic studies[J]1Mol1B i ol11970,53: 401-171[4]SacK mann E1Sapported me mbranes:Scientific and p racti2 cal app licati ons[J]1Science1996,271:43-481[5]Schuck P,M int on AP1M ini m al require ments for internal consistency of the analysis of surface p las mon res onance bi osen2 s or data[J]1Trends B i ochem1Sci11996,21:458-601[6]Van der Mer we P A,Barclay AN1Analysis of cell-adhe2 si on molecule interacti ons using surface p las mon res onance1 Curr1op in[J]1I m munol11996,8:257-611[7]Wolffe AP,Khochbin S,D i m itr ov S1W hat do linker his2 t ones do in chr omatin[J]1B i oessays1997,19:249-551[8]罗贵民,曹淑桂,张今1酶工程[M]1北京:化学工业出版社,2003177—811[9]段媛媛,刘德立1SPR生物传感器的特点及其在生物特异性相互作用分析中的应用[J]1生物技术通讯,2002,13 (1):72—751[10]王海明,钱凯先1表面等离子共振技术在生物分子互作研究中的应用[J]1浙江大学学报(工学版),2003,37(3): 354—3611[11]程慧,黄朝峰,段子渊1SPR生物传感器及其应用进展[J]1中国生物工程杂志,2003,23(5):46—491[12]吴英才,袁方,徐艳平1表面等离子共振传感器的研究进展[J]1传感器技术,2004,23(5):1—51[13]刘国华,常露,张维,等1SPR传感器技术的发展与应用[J]1仪表技术与传感器,2005,(11):1—51[14]向四海,崔大付,浩原,等1利用表面等离子体谐振生物传感器实时监测酶促反应的新方法[J]1分析化学,2003,31 (12):1425—14291第4期 刘小林:SPR生物传感器研究综述 第28卷。