• Millex®针头式过滤器：多种孔径/直径/接头可供选择
玻璃纤维膜 —— 预过滤
• Millex®针头式过滤器：多种孔径/直径可供选择
尼龙膜 —— 预过滤，单细胞分离
• Steri ip®过滤器：多种孔径可供选择
超滤 —— 蛋白/核酸/病毒的浓缩、除盐、缓冲液置换
再生纤维素膜 —— 超低蛋白吸附超滤膜
• MultiScreen® 96孔板：用于蛋白浓缩、除盐、缓冲液置换（cat# MAUF01010）
其它膜
• MultiScreen® 96孔或384孔板：用于纯化PCR产物、去除dNTPs和引物（cat#LSKMPCR10）
印迹研究 —— 对生物大分子有卓越的吸附能力
疏水性PVDF转印膜 —— 蛋白载量最大的膜
亲水性PTFE膜
• MultiScreen® 96孔板：用于天然产物筛选，可溶性分析，总药物分析（cat# MSRLN0410）
PCF膜
• Millicell® 96孔板：用于Caco-2细胞培养及细胞水平分析，包括细胞渗透性/粘附/培养/ 分化/药物转运等（cat#PSHT004S5）
再生纤维素膜
硝酸纤维素（NC）转印膜 • Immobilon®-NC 0.45μm传统WB常用转印膜（cat# HATF00010）
关于第六版
随着蛋白印迹手册第六版的 出版，默克密理博公司一如 既往地协助研究人员紧跟蛋 白检测的前沿进展。我们在 优化抗体浓度和降低背景方 面增加了更全面的建议，同 时扩展了荧光检测的数据和 操作步骤。
• Immobilon®-P 0.45μm最常用的WB转印膜（cat# IPVH00010） • Immobilon®-PSQ 0.2μm小分子蛋白/肽WB转印膜（cat# ISEQ00010） • Immobilon®-FL 0.45μm背景最低的荧光检测专用转印膜（cat# IPFL00010）
MCE（混合纤维素）膜 —— 经典常用膜
• Millex®针头式过滤器：多种孔径/直径可供选择
亲水性PTFE膜 —— 化学耐受性最好
• Millex®针头式过滤器：多种孔径/直径可供选择 • Ultrafree®系列离心微滤管：处理体积0.5或2mL，提供预除菌形式包装
疏水性Durapore® PVDF膜及疏水性Fluoropore® PTFE膜 —— 气体过滤，在线传感器保护
1
目录（续）
5
操作
31
1 蛋白转印的操作
32
1.1 电转印：槽转印
1.2 电转印：半干转印
1.3 斑点印迹/狭缝印迹：真空过滤法
1.4 Spot印迹：手工点样法
1.5 封闭试剂的优化
1.6 膜干燥方法
1.7 创新方法：间接印迹以避免二抗的非特异性结合
2 蛋白观察的操作
41
2.1 通过透照法观察
2.2 通过可逆染色观察
这本手册代表了我们应用科 学家的集体经验和智慧—— 正是他们一直积极参与推进 蛋白印迹和检测技术。这本 手册也包含了我们技术服务 专家团队所提供的许多最常 见的建议，世界各地的科学 家常常联系他们寻求帮助。
更好的膜， 更好的印迹。
近四十年来，默克密理博一直是转印膜的领 先供应商。1975年，E.M. Southern使用这些膜 首次创建了从琼脂糖凝胶上转移核酸1。第一 款 用 于 Western印 迹 的 0.45μm-PVDF基 质 ， Immobilon®-P膜，在1985年面市，而第一款 用于蛋白印迹和测序的0.2μm-PVDF基质， Immobilon®-PSQ膜，在1988年面市。
除了Immobilon®膜和试剂，默克密理博还为 蛋白研究提供了广泛的其它工具，包括温和 高效的蛋白提取试剂盒，通过PureProteome™ 磁珠快速分离蛋白，以及通过Amicon®-Ultra 离心超滤管高效浓缩除盐。
从何处获得更多信息 如果您有问题或需要协助，请联系默克密理 博的技术服务专家团队： 电话：400-889-1988-2分机 邮箱：asiatechserv@
默克密理博生命科学部
蛋白印迹技术手册（第六版）
• 基本原理 • 操作详解
• 经验技巧 • 疑难解答
• 常用工具
密理博(Millipore®)公司成立于1954年，总部位于美国麻 省，主要生产膜及以膜为核心的衍生产品。2010年默克 集团成功并购密理博公司，成立了新的具有强大创新能 力默克密理博部门，为全球生命科学用户提供更加有效 的解决方案和完整的产品线。膜的传奇还在继续……
亲水性PVDF膜 —— 蛋白结合最低的膜
• MultiScreen® 96孔板：用于完整细胞/细胞部分受体结合分析， 蛋白激酶/磷酸酶沉淀分析，珠子/树脂形式分析，新生儿 （苯丙酮尿症）筛查（cat#MSHVN4550）
• MultiScreen® 96孔板：通过临床诊断应用验证，用于蛋白激酶/ 磷酸酶分析、样品制备、末端染料去除（测序用）（cat#MAHVN4550）
66
实例分析与建议
68
专家之选——Western Blotting常用工具
74
2
简介
自 1979年 被 建 立 以 来 （ Towbin等 ， 1979）蛋白印迹已成为研究型实验室的 一种常规方法。它通常用于检测复杂样 品中的少量目的蛋白，或监控蛋白表达 与纯化。最简单的蛋白印迹操作被称为 斑点印迹或狭缝印迹，是用真空抽滤将 蛋白转移到一块微孔膜上。尽管这种方 法可提供蛋白整体表达水平的定量信 息，并可以平行开展多个样品的检测， 但它缺乏蛋白分子量的信息。同时特异 性也会受影响，因为蛋白降解产物或翻 译后修饰的异构体也能随着完整蛋白一 起被检测。
PES超滤膜 —— 孔结构松弛，适合浓度/粘度高的样品
• Stirred Cell系列超滤杯：3-400mL高浓度样品温和浓缩，可换膜
细胞培养表面 —— 三维生长，细胞运动，结合物分析
PET（聚乙烯对苯二酸酯）膜：用于贴壁细胞的生长，无需胞外基质
• Millicell® PET悬挂式细胞培养小室（cat#PIHT12R48，cat#PIRP12R48，cat#PIEP12R48）
• Amicon® Ultra系列超滤管（cat# UFC901096等） • Amicon® Pro纯化超滤管：1mg以内蛋白样品操作新标准工具 新！ • D-tube™系列透析管：温和换液、浓缩、电洗脱 • Microcon® 系列超滤管：DNA、蛋白浓缩；法医刑侦专用 • Centricon® Plus-70系列超滤管：15-70mL样品浓缩 • Stirred Cell系列超滤杯：3-400mL高浓度样品温和浓缩，可换膜
Millipore Express® PLUS PES膜 —— 过滤速度最快
• Millex®针头式过滤器：处理体积～200mL，直径33mm 规格系列最常用（cat# SLGP033RB等）
• Steri ip®过滤器：处理体积50mL • Stericup®/Steritop®过滤器：处理体积150mL-1L （cat#SCGPT05RE，cat#SCGPT10RE，cat#SCGPU05RE） • Sterivex®过滤器：处理体积2L（cat#SVGPL10RC） • Stericap®过滤器：处理体积2-10L （cat#SCGPCAPRE） • Steripak®过滤器：处理体积10-20L （cat#SPGPM10RJ，cat#SPGPM20RJ）
Stericup®/ Steritop®过滤器
适合150～1000mL培养基过滤、除菌 膜孔径、包装规格齐全 精巧设计带来满意体验 行业领先：最快：Millipore Express® PLUS PES系列
蛋白结合损失最低：Durapore® PVDF系列
Amicon® Ultra超滤管
用于蛋白、核酸、病毒、微粒等快速浓缩、除盐及换液 处理体积、截留分子量、包装规格齐全 行业领先：再生纤维素膜蛋白结合损失最低
丽春红
CPTS（酞菁铜四磺酸） 2.3 通过不可逆染色观察
考马斯亮蓝R染料 氨基黑
3 免疫检测的操作
44
3.1 标准的免疫检测方法
3.2 快速的免疫检测方法
3.3 利用SNAP i.d.® 2.0系统进行快速的免疫检测
3.4 高盐溶液清洗以去除顽固的背景
4 剥离膜上抗体的操作
51
4.1 通过加热和去污剂剥离
4.2 通过低pH条件剥离
4.3 利用ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit剥离
5 蛋白消化的操作
53
5.1 消化膜上蛋白以便进行质谱分析
6 印迹膜保存的操作
54
6.1 印迹膜制备以便长期保存
6
常见问题与改善建议
55
词汇表
参考文献
专利
7
附录
66
经验之谈：从容应对高难度Western Blotting
尝试建立蛋白鉴定的膜
用于染色和免疫检测
通过透照法观察和快速免疫检测
保存 蛋白观察
透照
染色
可逆染料
不可逆染料
4
蛋白鉴定
23
免疫检测
23
标准或快速免疫检测步骤
影响免疫检测的因素
缓冲液
封闭
抗体
清洗
间接印迹
检测底物
显色检测 化学发光检测 荧光检测
多轮杂交Immobilon® PVDF转印膜
质谱分析
29
利用Immobilon® PVDF转印膜进行质谱分析
默克密理博的膜技术产品 全面支持您的高效生命科学研究
Millex®针头式过滤器
适合～200mL样品过滤、除菌 以外观颜色区分膜材质（PES绿，PVDF黄，MCE蓝等） 直径、膜材质、膜孔径、包装规格齐全 行业领先：最快：Millipore Express® PLUS PES系列