蛋白质免疫印迹技术
人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对
RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电
泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
三、蛋白免疫印迹的应用
免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT),亦称酶联 免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB
抗体的结构
(二)用于免疫的动物
由于动物的遗传性不同,同一抗原对不同动物 或同种不同品系动物、或不同个体,产生特异 免疫应答的强弱是不同的。因此,进行动物免 疫时,必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康 动物。 常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一 般为6个月大小的动物。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得 抗血清数量。
抗原的提取与制备 1)0.5mg/mL菠萝蛋白酶以0.9%生理盐水溶 解配置(加少量NaOH促溶)(周二上、周五 上)。 2)纯化的鸡卵类粘蛋白(周四上午)。 3)1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置 (加少量NaOH促溶) (周四下午)。
苦味酸(以75%乙醇配置)标记小鼠
标记部位 头 左前肢 组号 1 2
加强免疫:初级免疫后两周进行。 取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀,制成油包水 的形态。 加强免疫:小鼠背部多点皮下注射,0.15mL/只小鼠
(1)用酒精棉球消毒待注射部位
(2)皮下多点注射,每点注射量应小于0.1mL。 第二次加强免疫:加强免疫一周后进行。操作相同。 第二次加强免疫后一周,即可采血,收集抗血清。 小鼠取血。收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃ 下,析出血清,离心,3000rpm,10min。吸出血清,分装 (0.05~0.2mL),贮于-20℃以下冰箱保存。
目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。
福氏佐剂(Freund adjuvant), 通常是由羊 毛脂1份、石腊油5份。这是不完全福氏佐剂。
在每毫升不完全佐剂加入1~20mg卡介苗就成 为完全佐剂。
(六)免疫方法
抗原剂量,首次剂量为10~50μ g,加强免疫的剂量 约为首次剂量的1/4。 首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫 时用不完全佐剂。 每2~3周加强免疫一次。
效价 抗血清的效价,就是指血清中所含 抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用 的是单向扩散免疫法,此法对所有的抗体 均适用。 某些由大分子(如蛋白类)抗原所产生的 抗体,可用双扩散等方法测定。
免疫扩散试验
1-抗原;2-7为不同稀释倍数的抗体
第二部分 Western-blotting 检测抗血清
(三)抗原
抗原是多种多样的,就其化学成分而言,有蛋白 质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
为了获得较好的抗血清,最好是选用蛋白质抗原。
不同的抗原,其免疫原性的强弱均不相同,这种 免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性 基团、立体结构等。
(四)免疫途径
免疫途径有多种多样,如静脉内、腹腔内、肌肉
免疫原性(immunogenicity)是指抗原刺激机体引起免疫应 答的能力。 免疫反应性(immunoreactivity)是指抗原与相应免疫应答 产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。
抗原的分类
抗原可以分为完全抗原和半抗原。 完全抗原:具有免疫原性和免疫反应性的抗原称 为完全抗原(complete antigen) 半抗原:只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原 称为半抗原(hapten),也称为不完全抗原 (incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完 全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞 发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂 都属于半抗原。
学习掌握动物抗血清的制备原理及技术 通过实际操作学会动物抗血清的制备 掌握Western-blotting的基本原理 熟悉Western-blotting的实验操作
二、实验原理
第一部分
动物的常规免疫及抗血清的制备
第二部分 Western-blotting 检测抗血清
第一部分
动物的常规免疫及抗血清的制备
因抗体主要存在于血清中,在抗原或抗体的检测中多采用 血清作试验,所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应 (serologic reaction)。
二、印迹法(blotting)
印迹法是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 (NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段 的方法,称为Southern 印迹法。
收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下, 过夜(切勿冰冻)析出血清,离心, 4000rpm,10min。在无菌条件,吸出血清,分装 (0.05~0.2mL),贮于-80℃以下冰箱,或冻干后 贮存于4℃冰箱保存。
(八)抗血清质量的评价
在免疫期间,不仅各个不同的动物,而且同一动物在 不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能 发生变化,因而必须经常地采血测试。只有在对抗血 清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后, 才可使用所取得的抗血清。
抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)
是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发 生于体内(in vivo),也可发生于体外(in vitro)。
体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用;
体外反应:可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应 及中和反应等各种不同的反应类型。
在第2次加强免疫后2周,从耳缘静脉取2~3mL血, 制备血清,检测抗体效价。如未达到预期效价,需 再进行加强免疫,直到满意时为止。当抗体效价达 到预期水平时,即可放血制备抗血清。
抗体的产生顺序与丰度
(七)抗血清的采集与保存
取兔血有两种方法,一是耳缘静脉或耳动脉放血, 一是颈动脉放血,也可心脏采血。 小鼠取血。
样 品 制 备 电 泳
转 膜
杂 交
探 针 制 备 分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图
结 果 显 示
Western Blot原理
将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上; 然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应;
洗涤去除没有结合的特异性抗体后;
加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗 体,反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合 的标记抗体; 加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等, 观察有无特异性蛋白条带的出现。
免疫印迹的实验包括五个步骤:
⑴ 固定:蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
⑵ 封闭:保持膜上没有抗体的结合场所,使场所处 于饱和状态,用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。
⑶一抗杂交:初级抗体(第一抗体)是特异性 的。 ⑷二抗杂交:第二抗体或配体试剂对于初级抗 体是特异性结合并作为指示物。
将适当的抗原物质注入动物体内,经过一定时间,动 物血清中可出现大量特异性抗体,这种含抗体的血清 称为免疫血清。
优质免疫血清的产生,主要取决于抗原的纯度和免疫 原性,以及动物应答的能力。此外,尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因 素。
(一)多克隆抗体的概念
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。 由一种抗原决定簇刺激机体,由一个B淋巴细胞接 受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体 (Monoclone antibody)。 由多个抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种 各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起 就是多克隆抗体。 机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。
如要获得大量的抗体,多采用大动物; 如要是获得直接标记诊断的抗体,则直接采用本动物; 如要获得间接的标记诊断用抗体,则必须用异源动物制备 抗体; 如果难以获得的抗原,且抗体的需要量少,则可以采用纯 系小鼠制备。
一般实验室采用的抗体,多用兔和羊制备,因动物反应 良好,而且能够提供足够数量的血清。
抗原和免疫原性
抗原(antigens,Ag)是指能够刺激机体免疫活性细 胞产生抗体或致敏淋巴细胞,并在体内或体外发生特 异性反应的物质。 常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋 白质、核酸、激素等有机物。 抗原具有两方面的特性:免疫原性(immunogenicity) 和免疫反应性(immunoreactivity)。
抗体的种类
抗体(antibodies,Ab)是专门对抗抗原特异 结构的球蛋白,故也称为免疫球蛋白 (immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液 中,是构成机体免疫作用的主要物质。
免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同, 分为五种类型: IgG、 IgA、 IgM、 IgD和 IgE。 人体血清中IgG含量最多, IgA次之, IgM较 少, IgD和IgE微量。
左后肢
背 右前肢 右后肢 左耳朵 右耳朵
3
4 5 6 7 8
初级免疫:小鼠背部多点皮下注射,0.2mL/只小 鼠 (1)抗原与佐剂的混合:取1.5mL蛋白与1.5mL 完全佐剂混合,震荡混匀,制成油包水的形态
(2)用酒精棉球消毒待注射部位
(3)皮下多点注射,每点注射量应小于0.1mL
初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应,两 周后进行加强免疫