site or polylinker)；
细菌裂解的方法：
• 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS • 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 • SDS裂解法：10%SDS,一般用于
质粒大量提取。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细 菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以 SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的 破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞 中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱 性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性 乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒 DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨 大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清 中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到 离心管的底部。通过这种方法即可将质粒 DNA从细菌中提取出来。
*溶液I： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。
*溶液2－0.2mol/L-NaOH, 1%SDS *溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，
28.5mL H2O *饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
分子生物学实验
时 间 安排
双周、周一下午1:00开始
评分考虑
1. 平时实验课成绩 70%； 2. 综合技术测验 30%。
实验操作基本要求
1. 认真预习实验指导； 2. 按照操作规程使用仪器设备, 注意个人以及
公共设施安全； 3. 节约实验试剂及材料； 4. 实验完毕后，将实验器皿清洗干净，并清理
3. 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS （溶液II ），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上 放置2--3min;
பைடு நூலகம்
4. 加入150 l乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒 6-7次混匀，冰上放置5min;
5. 用台式高速离心机，12000r/min离心10min， 上清移入另一干净离心管，并加3ul RNaseA, 37C保温45min;
实验台面； 5. 按时、按质、按量完成实验工作，不迟到，
不早退； 6. 实事求是、认真而及时地写出实验报告。
质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外， 能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某 些性状。天然的质粒都是环状双链DNA，大小 从5kb到400kb不等。质粒虽然独立于染色体外 自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码 的酶和蛋白质复制因子。质粒按照其稳定拷贝 数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒 在每个细菌细胞中有1～5拷贝，松弛型质粒在 每个细菌细胞中可达10～200个，甚至更多拷贝。
质粒的结构：
1. 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
9. 沉淀溶解于30ul TE溶液，取10ul 电 泳检查
琼脂糖凝胶电泳
电泳体系： 1％琼脂糖凝胶， 电泳缓冲液：1 × TAE （由50 × TAE稀释） 电泳方式：稳压，<5/cm
100ml 1％琼脂糖凝胶配制方法： 100 ml 1 × TAE 溶液中加入1克琼脂糖 染料：GoldView DNA染料（上海赛百盛公司） 染料用量：5ul/100ml凝胶 显色：紫外灯下，双链DNA呈绿色
6. 上清中加入等体积的酚/氯仿抽提一次,等体积 氯仿抽提一次;每次均要振荡—离心(10000rpm 离心1min) —吸取上清到新的离心管中;
7. 上清中加入1/10 体积3M乙酸钠溶液(pH5.2) ,和 2.2倍体积的无水乙醇,混匀后-20℃保存。
8. 12000rpm 离心20分钟，弃去上清，沉 淀加入1ml 75％乙醇洗涤， 12000rpm 离 心2分钟，彻底弃去上清，真空干燥或烘 干。
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与70％乙醇
质粒小量提取的方法：
1. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到 1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃ 培养12～16小时;
2. 取 液 体 培 养 液 1.5-3ml 于 Eppendorf 管 中 ， 10000r/min 离 心 1min ， 去 掉 上 清 液 ， 加 入 100l溶液I，充分混匀;置冰上;
单链DNA呈红色