猪圆环病毒2型病毒样 颗粒疫苗的研究
汇报人： 张 2011.11.17 鹏
提纲




研究背景 总体思路 疫苗抗原的选择及优化 表达系统的选择 原核大肠杆菌系统及优化 真核酵母表达系统及优化 佐剂的选择 保护剂的选择 疫苗的最终组装
研究背景

猪圆环病毒（PCV-2）自2000年传到中国，目前以广泛流行于我国绝大部分猪 场。PCV-2导致猪免疫力低下和严重的发育障碍，是危害世界养猪业的最为重 要的疫病之一。目前很多人把PCV-2称做猪的HIV。 PCV-2疫苗主要为细胞灭活苗和杆状病毒载体疫苗。 灭活苗使用PK-15和PKK细胞（从PK-15中挑选对PCV-2敏感的细胞克隆） 扩增PCV-2。这两株细胞系均可扩增 PCV-2，但是病毒增殖3-5代后才可看到 70%左右的细胞病变（CPE），病毒滴度低。由于病毒得到比较困难，所以 PCV-2灭活苗的每个头份都在10元以上，这比普通疫苗的价位高10-20倍。 杆状病毒圆环疫苗主要是生产Cap病毒样颗粒或Cap/Rep（ ORF1（PCV-1） /ORF2(PCV-2) ）嵌合病毒颗粒样疫苗。即用杆状病毒表达所形成的嵌合病毒 样颗粒。该疫苗具有非常好的免疫效果。但是因为蛋白纯化的的高费用和免 疫时所需的高抗原剂量，因此价格每头份在30元左右，成本高。 我们目标：应用现代分子生物学方法生产圆环病毒2型的病毒样颗粒，结合传 统和新型疫苗佐剂，开发具有自主知识产权的，成本低，免疫效果好的猪圆 环病毒2型病毒样颗粒疫苗

C端融合TC Tag标签的Cap C端融合DC靶向 Tag 标签的Cap C端融合胸腺肽α1（27aa) 的Cap C端融合胸腺肽α1+ DC Tag 的Cap
对病毒颗粒形成的检测

1） 表达野生型和改造后的Cap蛋白，纯化 后的蛋白通过电镜负染，观察病毒样颗粒 的是否形成以及形态。
Hsp16.5 PCV2 VLPs
真菌疏水蛋白作为圆环病毒病毒样 颗粒口服疫苗的保护剂研究

真菌疏水蛋白是一类具有强表面活性的分 泌型小分子量蛋白质。疏水蛋白的重要特性是 能在亲水 - 疏水界面通过自我组装形成一层紧 密稳定的约10nm厚的两性蛋白膜。疏水蛋白 具有表面活性并能够自我组装，疏水蛋白对温 度却非常的稳定 同时既无带细胞毒性也无强 免疫原性 , 有望成为疫苗耐热保护剂和口服导 入的良好载体。
TC Tag C端 病毒样颗粒动态示踪 V5 Tag DC细胞 M细胞 靶向tag
标记病毒样颗粒疫苗
DC或M细胞靶向疫苗
N端
异源核酸
DNA疫苗导入系统
表达系统的改进
1 SUMO原核表达载体系统的优化 1） 抗原部分优化 （参考上一张幻灯片） 2）表达载体优化 （1）纯化标签由原先His标签改为MBP标签； 增加可溶性和纯化纯度，降低纯化成本。 （2）在MBP标签前加入TEE增强剂，增强 Cap蛋白的表达。 （3） 构建Cap -SD序列多重串联融合表达载 体，实现对Cap的多重高效表达。
2）用改造后的cap基因替换野生型PCV-2基 因组中的cap基因，转染猪视网膜上皮细胞， 检测是否有病毒粒子的产生。

利用原核SUMO表达系统生产圆环 病毒病毒样颗粒
Cap目的蛋白 表达载体 pSMK-cap pSMK载体 在大肠杆菌 rossta中表达 蛋白纯化， 切除sumo 标签，获得 天然蛋白 扫描电镜 观察病毒样 颗粒
利用pP-αhSUMO3 酵母表达系统生 产圆环病毒病毒样颗粒目的 Nhomakorabea因cap
重组酵母 表达质粒p pP-αhSUMO3-Cap 表达载体pP-αhSU MO3-Cap
蛋白纯化， 扫描电镜 Sumo 蛋白酶 在毕氏酵母 观察病毒样 GS115中表达 切除sumo 颗粒 标签，获得 天然蛋白
酵母表达优化策略


总体思路
大肠杆菌SUMO 表达系统 酵母SUMO 表达系统
真菌疏水 蛋白保护剂 口服免疫 免疫效果 评价
免疫佐剂 注射免疫
疫苗抗原



1） wt-Cap 2) N 端缺失的Cap 3） N端密码子优化的Cap 4) N端修饰的Cap 5) 6） 7） 8)
（多个Cap修饰蛋白）
Cap 的M变为C（半胱氨酸）后可被单一聚二乙醇(PEG)修 饰。修 饰后的Cap在体内半衰期延长。
真菌疏水蛋白作为圆环病毒病毒样 颗粒口服疫苗的保护剂研究
颗粒样疫苗在 胃肠道中稳定性
真菌 疏 水 蛋白 包裹 疏水蛋白的 脱膜条件和位点 疏水蛋白对病毒 样颗粒进入 DC细胞和M细胞的影响
圆环 病毒 病毒样颗粒
口服 途径 免疫动物
评价真菌 疏水蛋白作为 口服疫苗保护剂 的可行性
免疫效果检测
后续开展工作



1 按照标准实验方案完成对野生型Cap的表达， 纯化，完成相关专利的申请。 2 合成切割SUMO-3相关的蛋白酶，降低购买 商品化蛋白酶的昂贵成本。 3 根据原核表达情况，选择免疫原性更高的 改造后Cap做为抗原，同时利用优化后的酵母 表达系统对Cap进行真核表达。
圆环病毒样颗粒疫苗新型佐剂研究