第一章绪论1基因:是指DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。

2管家基因与奢侈基因：具有相同遗传信息的同一个体细胞间其所利用的基因并不相同，有的基因活动是维持细胞基本代谢所必须的，而有的基因则在一些分化细胞中活动，这正是细胞分化、生物发育的基础。

前者称为管家基因，而后者被称为奢侈基因结构基因与调节基因：结构基因是可以转录成为各种RNA（rRNA,tRNA,snRNA）直接行使功能，或者转录成信使RNA（mRNA）然后翻译成多肽链，最终形成各种功能蛋白质和酶。

从广义上讲，任何一种能够调节或限制其他基因活性的基因都可以叫做调节基因。

移动基因：转座子属于可移动的遗传因子重叠基因：它的同一部分DNA可以编码两种不同的蛋白质，也就是说同一部份DNA存在2个重叠基因3基因组:是指一个生物体、细胞器或病毒的全部基因4断裂基因:被间隔序列间隔成若干个部分，而形成不连续形式的基因，是真核基因的普遍形式5假基因:是一类在基因组中稳定存在，序列组成也酷似正常基因，但不能表现出任何功能的DNA序列。

6启动子：DNA链上能指示RNA转录起始的DNA序列称为启动子，(1)-35序列提供RNA聚合酶全酶识别位点，(2)-10序列是酶与DNA紧密结合的位点，(3)RNA合成的起始点7复制子：DNA 中发生复制的独立单位称为复制子(Replicon)，这是一段具有特殊结构的DNA序列，载体有复制起点才能使与它结合的外源基因在宿主细胞中独立复制繁殖。

8增强子：就是远离转录起始点（1 ~ 30 kb）、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关。

9单克隆抗体：由单一细胞克隆生成的抗体是单克隆抗体，所有这些抗体分子都是相同的并以同样的亲合力结合在抗源的相同部位上10黏性末端：由限制性内切酶切割后在双链DNA的切口处产生交替互补的单链末端11操纵子：是指染色体控制蛋白质（酶）合成的功能单位，操纵子包括调节基因、操纵基因和结构基因12终止子：模板DNA上存在终止转录的特殊信号称为终止子。

13克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子细胞或由个体所组成的特殊的生物群体14亚克隆：就是对已经获得的目的DNA进行重新克隆，其目的在于对目的DNA 进一步分析或者进行重组改造。

15cDNA：由RNA逆转录形成的DNA2.问答题（1）DNA是遗传物质的证明试验是什么？Avery肺炎双球菌转化实验: 噬菌体转染实验进一步证实（2）第一个得到限制性核酸内切酶的科学家是谁？H. O. Smith得到第一个限制酶（3）基因工程的开创试验是谁做的，基因工程的突破性试验是谁做的，基因工程的元年是谁做的，基因最早是由谁认准提出的？Berg的开创性实验将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来Boyer-Cohen的突破性实验有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。

后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。

这是第一次成功的基因克隆实验。

1973年为基因工程的元年丹麦人1909年丹麦学者W.L.约翰森提出了基因这一名词,用它来指任何一种生物中控制任何性状而其遗传规律又符合于孟德尔定律的遗传因子,并且提出基因型和表现型这样两个术语,前者是一个生物的基因成分,后者是这些基因所表现的性状。

（4）基因工程的定义，三要素是，四要素是？在分子水平上，提取（合成）不同生物的遗传物质，体外切割，再与载体拼接重组，然后把重组DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向创造生物的新性状，并能稳定遗传。

三要素：供体载体受体四要素：供体载体受体工具酶（5）基因工程的步骤与特征。

（1）获——获取目的基因（2）连——基因+载体=重组体（3）转——重组体的转化与扩增（4）筛——筛选鉴定（5）表——基因表达。

特征：跨物种性无性繁殖（6）基因工程产生的理论基础与技术突破有哪些。

理论上的三大发现：第一发现了生物的遗传物质是DNA而不是蛋白质，第二明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制。

第三遗传密码子的破译。

2技术上的三大发现，第一利用限制酶和连接酶外切割和连接DNA片段，第二质粒改造成载体以携带DNA片段克隆，第三逆转录酶的使用打开真核生物基因工程的一条通道。

基因工程诞生的技术突破：1. 限制性内切酶2发现了DNA连接酶3使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。

在细菌细胞里的大量扩增4感受态体系经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。

5琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。

6. DNA测序技术（7）基因工程在农业生产中的主要应用有哪些。

（详见课本206--210）增加抗逆性（抗虫或抗病）-改变株高提高耐储藏能力和抗寒能力提高光合作用能力第二章工具酶工具酶：应用于基因工程的各种酶的总称同裂酶：也称异源同工酶，是指来源不同但具有相同识别序列的一类限制酶同尾酶：即指来源和识别序列都不同，但能够产生相同黏性末端的一组限制性核酸内切酶切口前移标记：双链DNA在DNA酶1的作用下形成单链切口，DNA聚合酶1的作用下利用5`到3`外切活性从切口的5`端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用切口的3`游离羟基逐个加上单核苷酸，使得切口向下游离。

Kl enow聚合酶：大肠埃细菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N 端三分之二的大太段即为.2.问答题（1）限制性内切核酸酶的种类有哪几种，其中称作剪刀的是Ⅰ型限制性内切酶具有限制和修饰两种功能；酶的识别位点与切割位点不一致，并随机切割DNA。

这类酶的作用需要Mg2+，S-腺苷甲硫氨酸及ATP激活Ⅱ型限制性内切酶具有限制和修饰两种功能；酶的识别位点专一，并在固定位置上切割双链。

这类酶的作用仅需要Mg2+Ⅲ型限制性内切酶具有限制和修饰两种功能；酶的识别位点专一，在固定位置上切割双链，但对于固定位置上的碱基对不专一。

这类酶的作用需要Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸及ATP激活（2）限制性内切酶的命名限制性酶名称的第一个字母（大写，斜体）代表该酶来源的微生物属名：第二，第三字母（小写，斜体）代表微生物的种名：若该微生物有不同的变种和品系，则加上该变种和品系的第一个字母，若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。

（3）限制性内切酶的基本特征。

1. 每一种酶都有各自特异的识别序列2. 限制性内切核酶识别序列具有180。

旋转对称的回文结构3. 有些酶具有同裂酶或同尾酶的特性4. 有些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同5. 识别序列的长短、识别序列的相邻序列效应、位点偏爱及星号活性影响DNA的切割（4）影响限制性内切酶活性的因素（前四条详见课本49--50）1. DNA的纯度和结构2. DNA的甲基化程度3. 酶切消化反应的温度4. 盐离子浓度5. 缓冲体系6. 反应体积和甘油浓度7. 酶切反应的时间（5）T4-DNA和T7-DNA及Taq DNA聚合酶聚合酶的特征。

T4-DNA聚合酶的特征：,5‘到3’DNA聚合酶活性和3；到5‘核酸外切酶活性2无dNTP时，可从任何3’-OH端外切3：只有一种dNTP时外切至互补核苷酸暴露时停止，并可发生取代反应，4在四种dNTP都存在时，聚合酶活性占主导地位。

T7-DNA聚合酶的特征同T4-DNA聚合酶相似，但持续合成的能力是目前已知最强的一种，现已经过处理，使其失去外切活性，获得测序酶Taq DNA聚合酶基本特征：1耐热2. 对Mg2+敏感3. 具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，忠实性差4. 有些物质可以起抑制作用。

（6）反转录酶有哪三种活性。

①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。

此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。

反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高[1]。

②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子[1]。

③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子（7）DNA连接酶的种类与连接方式1.大肠杆菌DNA连接酶（由NAD+供能）2. T4DNA连接酶（由ATP供能）连接方式：1.以黏性末端的方式连接2. 利用T4DNA连接酶以平末端的方式进行3. 加人工接头后以黏性末端的方式连接（8）提高平头连接效率的方法1加大酶用量，2加大平头末端底物浓度，增加分子间的碰撞机会，3加入10%的PEG8000，促进分子间的有效作用，4加入单键阳离子（NACL），最终浓度150-200mM（9）S1核酸酶，Bal 31核酸酶，碱性磷酸酶，T4多聚核苷酸激酶，末端脱氧核苷酸转移酶的特征与主要用途。

S1核酸酶：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA 1.去除DNA片断的单链突端2.去除cDNA合成时形成的发夹结构Bal 31核酸酶：单链内切双链外切的核酸酶诱发DNA突变碱性磷酸酶：1.去除DNA和RNA的5’-磷酸基，然后用T4多聚核苷酸激酶催化下，用放射性标记的ATP进行末端标记。

2.去除载体DNA 5’-磷酸基，防止自身环化。

T4多聚核苷酸激酶：在DNA、RNA dNR NR的5"oh上加磷主要用于5’-OH端的磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶：不需要模板1. 给载体或cDNA加上互补的同聚物尾巴2. 用于DNA片断3’末端的放射同位素标记第三章载体载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的运载工具叫载体报告基因：基因工程中利用载体上特地引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体已经进入宿主细胞，并用来将含有目的基因的宿主细胞从基它细胞中识别区分甚至挑选出，这种具有标志意义的基因称为报告基因。

蓝白斑选择原理：大肠杆菌β-半乳糖苷酶可分成2部分即α肽段（N-端的146个aa）和C-段。

α肽段的基因位于载体上并含有不影响其ORF（open reading）的多克隆位点（MCS），而C-段的基因位于工程菌E. coli DH5α上。

二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。