第八次实验：
牛血清白蛋白的
提取与鉴定
一、实验名称牛血清白蛋白的提取与鉴定
二、实验目的1、掌握盐析法提取牛血清白蛋白
2、掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法
鉴定牛血清白蛋白
3、了解用溴甲酚绿鉴定血清蛋白
三、实验原理1，蛋白质是水化作用较强的高分子物质，
向其加入碱土金属的中性盐类可是蛋白质胶粒脱水并失去
电荷，从溶液中沉淀出来。

球蛋白在半饱和的硫酸铵溶液
中可析出，而清蛋白则需在饱和的硫酸铵溶液中可析出。

可将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，
即可提取白蛋白。

2，利用电泳过程中带电粒子的移动速度
与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠
度等有关，可对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。

3，血清中
的白蛋白与溴甲酚绿在ph=4.2的条件下结合生成绿色化合
物，溶液由黄色变为绿色，而球蛋白基本不与之反应，缩
短反应时间可去除干扰，其颜色的深浅与白蛋白浓度成正
比，可用于鉴定牛血清白蛋白。

四、实验步骤
（一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS磷酸盐缓冲生理盐水稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（4000r/min）10min，将上清液倾入试管中。

（二）透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。

更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。

将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。

（三）BCG法鉴定
白蛋白+溴甲酚绿ph=4.2 绿色复合物
或（三）电泳鉴定
（1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位臵点样。

（2）电泳将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时膜条无光泽面向下，点样端臵于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将膜条取出。

（3）染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。

（4）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位臵是否一致。

五、实验仪器和试剂
仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色磁盘、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、分光光度计。

试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH为7.2的饱和硫酸铵溶液、溴甲酚绿、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氢氧化钠溶液。

六、预测结果透析后牛血清白蛋白溶液与溴甲酚绿反应溶液
由黄色变为绿色。

或电泳后位臵一致，则实验成功。

若在待测
液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。