实验1 细胞培养概述（一）细胞培养室的设置和无菌操作【实验原理】细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。

一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。

三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。

【实验目的】①了解培养室的设置和设备。

②学习无菌概念和无菌操作要领。

【操作步骤】1．实验室设置（1）配液室（2）准备室（3）培养室培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点：①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。

②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，③门一般用拉门，以防止空气流动。

④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。

2．实验室常用设备（1）准备室的设备①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。

②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。

③干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。

④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。

不同物品其有效灭菌压力和时间不同。

⑤储品柜1：放置未消毒物品。

⑥储品柜2：放置已消毒物品。

准备室注意事项：①预防蒸馏器被烤干。

②勿将酸液溅到衣物或地面。

③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。

④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。

（2）配液室的设备①天平（扭力天平和电子天平）：称量用②pH计。

③磁力搅拌器。

（3）细胞培养室的设备①超净工作台：超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。

根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。

但两种净化台的气流方向不同。

使用超净工作台应注意的几点问题：A．净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。

B．新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。

C．每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。

在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。

D．净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。

E．一般情况下，高效过滤器三年更换一次。

更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。

要定期将粗过滤器中的过布（无纺布）拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔3~6个月进行一次。

F．每次使用净化台要及时清除工作台面上的物品，并用洒精擦洗台面使之始终保持洁净。

②4℃冰箱和低温冰箱：③CO2培养箱：A．一定浓度的CO2对细胞生长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用（5%）。

B．一定浓度的CO2可维持培养液恒定的pH。

适用于开放培养，培养箱封口后，可在一般恒温培养箱内培养，但是采用培养皿或多孔板培养时，则需要高湿度和高CO2含量的空气。

C．它增加了湿度，箱体内装有水浴，可以保证培养箱内的湿度。

D．培养箱内装有紫外灯。

E．通过气体流量计可以调节CO2和空气的比例。

F．在水中可加入防腐剂（二氧乙酸）。

可防止因CO2培养箱中湿度较高，易长霉菌。

④离心机：⑤CO2钢瓶：⑥液氮罐：⑦储品柜：用来存放杂物⑧紫外灯：⑨空气净化系统⑩倒置显微镜3．无菌操作（1）无菌室的灭菌：①紫外灯无人时就要打开；②进无菌室要穿无菌服、戴帽子和口罩；③每周清洗消毒一次；④所用物品要以外科手术方式严格消毒；⑤室内台面要要保持洁净，做完实验后，用75％酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等；⑥所用物品要一次性准备好；⑦瓶口要用酒精火焰消毒；⑧尽量减少出入。

（2）实验人员的无菌准备：①肥皂洗手②穿好隔离衣③酒精棉球擦手【实验报告】画出一个标准细胞培养室的草图，标明各室的必须设备。

【思考题】1．观看演示填写出无菌操作的要领。

2．在无菌室工作时应注意的事项是什么？3．实验过程中如何才能在头脑中形成良好的无菌概念？（二）器械的清洗与消毒【实验原理】在组织培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。

毒性物质包括解体的微生物及细胞残余物以及非营养的化学物质，因此对新采用和重新使用的培养皿等培养用品都要严格清洗和消毒。

【实验目的】学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。

【仪器、材料及试剂】1．仪器：超净工作台，干燥箱，高压锅，过滤器。

2．材料：0.22μm微孔滤膜。

3．试剂：75%酒精，0.1%新洁尔灭，高锰酸钾，重铬酸钾，浓硫酸。

【操作步骤】1．清洗（1）玻璃器皿的清洗步骤：按浸泡→刷洗→浸酸→冲洗等四步程序进行。

①浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%~5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。

要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。

用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。

②刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。

要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。

禁止用去污粉。

因其中含有砂粒。

会严重破坏玻璃器皿的光洁度。

特别注意刷洗瓶角部位。

酸浸之前要把洗涤剂冲干净。

③浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。

清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。

经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全清除。

④冲洗：先用自来水充分冲洗，吸管等冲流10min，瓶皿需每瓶灌满、倒掉，反复10次以上。

然后再经蒸馏水漂洗3次,不留死角。

晾干或烘干备用。

对已用过的器皿，凡污染者必先经煮沸30min或放3%盐酸中浸泡过夜，未污染者可不需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。

【附】清洁液的配制和使用注意事项1.清洁液(配方见表2-1)配方成分弱酸次强液强液重铬酸钾（g）清水（ml）浓硫酸（ml）硫酸浓度（v/v）501000908%100100016014%6020080080%①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。

②先将重铬酸钾溶于水（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。

③缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险(绝不可将重错酸饵液倒入浓硫酸中)。

④清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。

由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好防护。

2．矽酸钠洗液贮存液(×100)砂酸纳80克加偏磷酸钠9克加热溶在1000ml水中。

使用时用水稀释100倍，将器皿放入煮沸20min，冷却后冲洗，再用2%HCl浸泡2h后，自来水冲洗。

矽酸钠洗液较清洁液安全，但价格较贵。

（2）塑料器皿清洗自来水充分浸泡→冲洗→2%NaOH浸泡过夜→自来水冲洗→2%~5%盐酸浸泡30min→自来水冲洗→蒸馏水漂洗3次→晾干→紫外线照射30min(或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照射30min)。

凡能耐热的塑料器皿，最好经101.3kPa(121.3℃)高压灭菌。

（3）胶塞等橡胶类处理新购置者先经自来水冲洗→2%NaOH煮沸15min→自来水冲洗→2%~5%HCl煮沸15min→自来水冲洗5次以上→蒸馏水冲洗5次以上→蒸馏水煮沸10min，倒掉沸水让余热烘干瓶塞等。

或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经101.3kPa高压灭菌。

（4）金属器械的清洗新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。

用过的金属器械应先以清水煮沸消毒，再擦拭干净。

使用前以蒸馏水煮沸10min，或包装好以101.3kPa 高压15min。

（5）除菌滤器的处理用过的滤器将滤膜去除，用三蒸水充分洗净残余液体，置干燥箱中烘干备用。

2．包装包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。

包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。

包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好；后者适于较小培养瓶皿、吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其它物品可参照处理。

①瓶类：硫酸纸罩以瓶口,外罩二层牛皮纸用绳扎紧。

②小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可装人饭盒，饭盒再以牛皮纸包好，绳扎好。

③吸管、滴管口用脱脂棉塞上(不要太紧或太松)装人消毒筒内，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。

④无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。

3．消毒灭菌严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化学法两类。

前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学消毒剂等。

①热灭菌：玻璃器皿，160~170℃，90~120min或180℃45~60min。

②蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa(115℃)高压灭菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa(121.3℃)高压灭菌15~20min。

③滤过除菌：适于含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为0.22μm微孔滤膜可除去细菌和霉菌等，用此滤膜过滤两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。

④紫外线：紫外线的波长为200~300nm，最强是在254 nm，6~15平方米最少一只紫外灯，高度要在2.5m 以下，湿度45%~60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于30分钟的照射时间。

⑤熏蒸消毒：当遇有细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可用高锰酸钾5~7.5g，加甲醛（40%）10~15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24h，至少4h 以上。

⑥煮沸消毒：紧密情况时使用，金属器械和胶蹇在水中煮20~30分钟，趁热倾去水分即可使用。

⑦化学消毒：化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制进行消毒灭菌的方法。

实验室桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。