称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃ ) CTAB及β-巯基乙醇 称取样品，液氮研磨，加入预热的 ℃ 及 巯基乙醇
保温1h,期间不停的摇均 保温 期间不停的摇均 吸取上清液,移至新的离心管中 加入等体积氯仿 异戊醇（ ： ）， ），轻缓颠倒 吸取上清液 移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 移至新的离心管中 加入等体积氯仿： 混匀,10000rpm,10min 混匀 取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇 颠倒混匀 加等体积氯仿： 颠倒混匀, 取上清液，移至新的离心管中 加等体积氯仿 异戊醇,颠倒混匀 10000rpm,10min
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷 的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
CTAB法流程图 法流程图
植物材料 裂解液
异丙醇沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液 溶液
细胞裂解
Hale Waihona Puke 上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的作用 中
CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使 酚容易去除。
取上清液，加入 的异丙醇（ ），后 取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀 的异丙醇 预冷），
10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干 离心取沉淀， 乙醇清洗两次， 离心取沉淀 乙醇清洗两次 溶解DNA,然后低温保存 用TE溶解 溶解 然后低温保存
应注意的问题
DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙 沉淀： 沉淀 醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀， 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。
DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。 干燥： 干燥 DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。 溶解： 溶解
原 因
1. 2.
3. 4.
DNA中含有蛋白、多 DNA中含有蛋白、 中含有蛋白 糖、多酚类杂质 DNA在溶解前 在溶解前， DNA在溶解前，有酒 精残留， 精残留，酒精抑制 后续酶解反应 DNA中残留有金属离 DNA中残留有金属离 子 RNA的存留 有RNA的存留
•
对 策
• • •
重新纯化DNA， 重新纯化DNA，过吸附 DNA 柱去除蛋白、多糖、 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质 重新沉淀DNA DNA， 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 增加70 70％ 增加70％乙醇洗涤的 次数（ 次数（2-3次） 加入RNase降解RNA RNase降解 加入RNase降解RNA
DNA提取和常见问题 提取和常见问题 分析及对策
主讲人： 关锰
DNA简单介绍
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高 分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。
DNA提取原则 DNA提取原则
保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染
DNA提取常见问题 DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。 问题二：DNA降解。 降解
原 因
1.
1. 2. 3. 4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 对 酶的活性 策 提取过程操作过于剧 DNA被机械打断 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
2. 3.
4. 5.
尽量取新鲜材料， 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后， 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 DNA时 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量， 的含量，细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制， 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 DNA分装保存于缓冲液中 分装保存于缓冲液中， 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
植物要匀浆研磨充分 增加吸附的时间， 增加吸附的时间，或低 温沉淀
4.
小心操作
CTAB提取缓冲液的改进配方 提取缓冲液的改进配方
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚 形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效 去除多糖。
除蛋白质： 除蛋白质：
氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机
相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程 中出现的气泡）。
DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法
一、染色体DNA的提取 染色体 的提取
CTAB法 CTAB法 SDS法 法 其它
DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法
二、非染色体DNA的提取 非染色体 的提取 质粒DNA的提取 的提取 质粒
• 碱裂解法 • 煮沸法
线粒体、叶绿体 线粒体、叶绿体DNA的提取 的提取
基因组DNA的检测 基因组DNA的检测
高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 µg/ mL 双链 DNA， A260/280 约为1.8
DNA提取常见问题 DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 样品不纯 PCR反应
DNA提取常见问题 DNA提取常见问题
问题三：DNA提取量少。 问题三：DNA提取量少。 提取量少 原 因
1. 2. 3. 4.
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 吸附或沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 洗涤时DNA丢失 DNA 对 策
1.
尽量选用新鲜（幼嫩） 尽量选用新鲜（幼嫩） 的材料
2. 3.
• 差速离心结合 差速离心结合SDS裂解法 裂解法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） 法原理（植物 提取经典方法） 法原理 提取经典方法
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基 三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。
应注意的问题
材料准备： 材料准备：
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。
液氮研磨： 液氮研磨：
研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮 挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽 量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。
细胞裂解： 细胞裂解：
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。 高温温浴时，定时轻柔振荡。
使用变性剂变性 高盐洗涤 蛋白酶处理
（SDS、异硫氰酸胍等）
除多糖： 除多糖：
高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积 的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以 与多糖的羟基作用，从而去除多糖
。
除酚类物质： 除酚类物质：
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基 乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类 与DNA的结合
除盐离子： 除盐离子：
70％的乙醇洗涤
TE中成分的作用 中成分的作用
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解