第十一讲基因工程模因工程模型梁虹中国医学科学院医学实验动物学研究所2011-10-28WASHINGTON, DC - The international MouseGenome Sequencing Consortium today announcedthe publication of a high-quality draft sequence ofthe mouse genome - the genetic blueprint of amouse - together with a comparative analysis ofthe mouse and human genomes describing insightsgleaned from the two sequ en ces. Th e paperappears in the Dec. 5 issue of the journal Nature.The Mouse Genome And The Measure of ManDecember 2002基因工程技术，包括基因打靶、基因沉默和转基因技术等首先在小鼠的基因修饰和品系培育上广泛使用，并产生了大量的基因剔除、转基因疾病小鼠模型和基因功能研究模型，成为生命科学研究、医学研究和药学研究的重要支撑条件，并推动了对生命规律的探索和医药研究的发展。
基因导入方式一、显微注射法在倒置显微镜下通过显微操作系统用注射针将DNA样品注射到受精卵雄原核中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。
�特点：对DNA大小无限制，不需要载体，转基因成功率约20%，外源基因在小鼠染色体上常呈成串的头尾项链的多拷贝插入。
�缺点：外源基因的插入位点和插入拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变。
二、慢病毒感染法将具有一次性感染的病毒注射到小鼠受精卵透明带下。
�特点：转基因成功率和转基因表达率可达到70%以上，且大多为单拷贝或低拷贝整合。
�缺点：目的基因插入容量＜10kb，制备病毒需要一定的安全考虑。
三、精子载入法将精子与DNA混合，然后通过单精注射或IVF获得转基因小鼠。
1.2 原核注射与受精卵移植1.31.4 转基因小鼠外源基因表达的检测�染色体和基因水平：分离基因组DNA，进行Southern 杂交和PCR分析，以评估外源基因的整合情况。
�转录水平：Northern杂交，RT-PCR。
�蛋白质水平：Western印迹分析。
1.5 转基因动物应用1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达的时相；2、在活体内研究或发现基因的功能；3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究；4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型；5、遗传性疾病的研究；6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据；7、动物新品种的培育；8、基因工程产品的制备。
1.6 转基因技术存在的问题1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特定部位；2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基因组功能；3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同，可能出现不同表现型；4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传。
基因打靶（gene targeting ），是利用DNA 同源重组原理，在基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段。
包括基因敲除（gene knock out ）和基因敲入（gene knock in ）。
目前，基因打靶技术已经被广泛应用于几乎所有生物医学领域——从基础研究到新疗法，使得人类对于心脏病、癌症和糖尿病等多种疾病有了更加深入的了解。
美国犹他大学 马里奥.卡佩奇美国北卡罗来纳州大学 奥立佛.史密斯英国卡迪夫大学 马丁.埃文斯由于在基因打靶技术的贡献分享2007年诺贝尔生理学或医学奖。
第二节第二节基因打靶动物模型（嵌合体小鼠）•胚胎干细胞：ESC 是从早期胚胎内细胞团（ICM ）分离的一种具无限增殖能力和全向分化能力的细胞。
胚胎干细胞（Embryonic Embryonic Stem Stem Stem CellCell ，ES ) 全能性 是ES 细胞具有可塑性的基础；无限扩增性 为实验和应用提供了大量的原材料或工具；可操作性 导入异源基因，报告基因或标记基因，诱导基因突变，基因打靶或导入额外的原有基因使之过度表达。
Selectable Markers and Reporter �Select markerNeomycin phosphotransferase gene (neo R)(drug:G418)Puromycin selection (Puro)(drug:puromycin)�Reporter�-geo (LacZ and neo) was the most widely used reporter (X-gal stain）EGFP is now popularLength of Homology•1.7 kb or less of total homology resulted in 0 target clones using Hprt vectors.1.9 kb of total homology resulted in targeted clones。
Targeting frequency increased as the total length of homology increased up to 6.0 kb。
Increases in total homology greater than 6.0 kb did not increase the targeting frequency (Data from Hprt locus Hasty et al., 1991; MCB) Positive/negative Selection•Positive selection to identify all transformants (both targeted and non-targeted)•Negative selection to enrich for targeting events•A proportion of double selected ES cell clones are targetedMethods for Identifying Homologous Recombinants •PCR•Southern blotES cell injection into the blastocystsMouse ChimeraCre-lox P和FLP/FRT系统�Cre/loxP：来自P1噬菌体，Cre重组酶基因和loxP序列位于P1噬菌体基因组内，loxP是Cre酶的识别序列，FLP/FRT：来自酵母，FRT是FLT酶的识别序列。
�Cre（FLP）重组酶有删除/整合、倒位、转位等功能。
�基本策略是通过类似于基因敲除的方法将两个loxP位点同向引入到要删除的基因片段两侧。
The FLP recognition target (FRT)has the same architectureTissue-specific deletion strategyMouse Knock-ins–WHY?�Test function of a specific residue or domain �Create model for equivalent change indisease state�Tag protein�Test functional equivalence of genes�and many, many more…1. promoter trap vector2. Poly-A Trap VectorOne trap cloneWild mouseChimera mouseF1+/+ +/trap +/trap +/+IGTC–The International Gene Trap Consortium•GOALS�Create an international resource ofES cells with gene-trap insertions inmost genes�Develop a standardized identificationand annotation protocol for gene trap lines�Integrate gene trap insertion tags into public genome databases andbioinformatics sites�Facilitate public access to the gene trap insertion lines and gene trapinformation IGTC Cell lines in database: 63244 IGTC Ensembl genes represented: 8176 IGTC current genome coverage: 41.9102 %RNA干涉实验的基本过程1、确定干涉靶点选择目标基因是进行RNA干涉的第一步，根据靶基因序列，确定干涉的具体靶点。
一般作为干涉的靶点序列应具备：①、目标RNA上被干涉的靶点应尽量避开蛋白结合位点②被干涉的靶序列一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征，同时G：C比为50%左右③被干涉的靶序列应该是特异性的，和其它RNA没有同源性。
2、双链干涉RNA的合成；化学合成法；体外转录法3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉：首先，将干涉RNA转染到靶细胞；其次，对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上进行监测RNAi实例：Target gene：c-myc�查找靶基因mRNA�利用网络在线支持，寻找siRNA序列�根据目的选择实现RNAi的策略：推荐载体法。
�根据查找的siRNA序列，合成长链oligo�构建载体�转染�检测效应（包括干扰效应和生物学效应）。