如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢 的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细 胞。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受 损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油， 它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿 透细胞。
影响冷冻效果的因素
①从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃温水中并 不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
②打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
③1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
④沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分 钟，弃上清液。
⑤加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃ 培养，第二天观察生长情况。
⑤细胞浓度计算： 四大格的细胞总数除以4，得 出平均每大格的细胞数，每大格的容积为 0.1mm3，因此，不同稀释倍数细胞悬液的细胞 浓度可用下式计算：
细胞浓度（细胞数／ml）＝（四大格的细胞数／ 4）ⅹ10000ⅹ稀释倍数
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团， 应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明 分散不好，需重新制备细胞悬液
1、冷冻速率 细胞冷至-10--15℃之间时，细胞外溶液先
出现结冰，而细胞细胞内仍保持未结冰状 态、细胞内未结冰的水分子会向细胞外流 动。 冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内 溶质浓度增高、细胞不发生结冰。 冷冻速度快，细胞内水分没足够时间外渗， 会发生结冰。
2、冷冻保存温度 液氮（-196 ℃）是最佳保存温度。
活细胞中的脱氢酶能将MTT还原成不溶于水的蓝 紫色产物（甲臜，Formazan)，并沉淀在细胞中， 其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。而 死细胞没有这种功能。
酸化异丙醇能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物， 溶液颜色深浅与所含的Formazan量成正比，最 后用酶标仪测定OD值。
①细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 ②沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。 ③37℃下保温2小时。 ④加入4-5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 ⑤1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度
一、实验目的： 1．掌握测定细胞活力的方法。
二、实验原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能 生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每 毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细 胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞， 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由 组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离 的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也 要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
作业： 1．细胞冻存与复苏的基本原则是什么？ 2．冻存液的作用是什么？
2．细胞活力测定
台盼蓝活力测定机理： 正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，
使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完 整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成 蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细
胞已经死亡。
①将一定浓度的细胞悬液与0.4%台盼兰以9:1混 合。
②染色2一3分钟。
⑥贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管 外拴一金属重物和一细绳。
⑦按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰 箱冷冻室（-20 ℃ ）（1小时）→气态氮（过夜） →液氮。
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期 检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立 升பைடு நூலகம்液氮能用1～1.5月。
2．复苏
四、操作步骤 1．冻存
①胰酶消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。 ②1000rpm离心5分钟，弃上清液。 ③沉淀加含保护液的培养基（培养基： DMSO=1:1），计数，调整至5×106/ml左右。 ④将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
⑤将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封 口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色， 从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些 酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相 对数和相对活力。
三、实验材料
仪器、材料与试剂 1．仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、
吸管、分光光度计。 2．材料：细胞悬液。 3．试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮
③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细 胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外， 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑 到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
3．MTT法测细胞相对数和相对活力
计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，
不能测定细胞绝对数。
细胞的冻存和复苏
一、实验目的
掌握细胞冻存的方法。
二、实验原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外 环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机 械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、蛋白 变性等，引起细胞死亡。
3、复温速度 越快越好，37 ℃水浴中，1-2min完成复温。
4、冷冻保护剂 保护细胞免受冷冻损伤的物质，常用甲亚 砜（DMSO）和甘油。
三、实验材料
1．仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮罐，离心 机，水浴锅，微量加样器等
2．材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿 瓶）、离心管、吸管等。
3．试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培 养基（即冻存液）等。
唑盐（MTT）、酸化异丙醇
四、操作步骤
1．细胞计数 ①将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖
片盖在计数板上。 ②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，
使悬液充满盖片和计数板之间。 ③静置3分钟。
④计数 ：在低倍镜下计算计数板的四角大方格 （每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。数 出计数板上计数室四角四大格中的细胞数，如细 胞压在格线上时，数上不数下，数左不数右。