第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
2.2.3醋酸菌的分离纯化2.2.3.1分离纯化实验称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，涂布在分离培养基上，培养2d后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。
连续在平板上培养3次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈又大又清晰的单菌落，转接并保藏于4℃的冰箱。
2.2.3.2 革兰氏染色实验将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24 h，制作水晶镜片进行革兰氏染色。
2.2.3.3产醋酸定性实验[38]取活化好的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3% (v/v) 的无水乙醇，32℃震荡培养60 h，取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液（2.5 mol/L）调节pH至7.0，加入5~6滴5% FeCl3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。
根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌[39]为醋酸菌。
2.2.3.4醋酸定量实验经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32℃、140 r/min恒温震荡培养60 h后，检测其发酵液中总酸，每株平行3组。
醋酸定量测定[40]：精确吸取发酵液2 mL至250 mL三角瓶中，并加入蒸馏水50 mL，滴加1~2 滴0. 5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微粉色。
产酸量(g/L)=(V-V0)×C NaOH×60/样品毫升数；式中：V=发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；V0=以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数；C NaOH=NaOH溶液的浓度(mol/L)；60为醋酸分子量。
2.2.3.5耐酒精能力实验初筛所得的菌株，分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养，无水乙醇体积分数从5%到14%，每个梯度相差1%，32℃恒温培养3d，观察其是否生长，筛选出耐酒精性能好的菌株。
2.2.3.6传代稳定性实验[41]将上述所筛选出的菌株，每隔一个月，转接纯化后的菌株，连续转接培养7代，并测定其酸度，来判断、筛选，传代最稳定和产醋酸最高的菌株。
2.2.3.7 不同保藏方法保藏醋酸菌的存活期限实验[43]将传代相对稳定性的菌株，分别按照培养基2.2.2中的⑶、⑷、⑸转接，待斜面上菌苔丰厚，保藏于2℃～4℃的冰箱内，每隔三个月再次转接，并观察其存活情况。
2.2.4 菌种鉴定实验[44-45]2.2.4.1培养实验观察通过平板培养，观察菌落形态特征，并挑取单个菌落制做水晶片，革兰氏染色，同时在1000倍光学显微镜下观察其细胞形态、大小和排列特征。
2.2.4.2培养特征实验⑴观察所选菌株在平板上培养的情况；⑵观察所选菌株是否能在高糖培养基上生长；⑶观察所选菌株是否能在Hoyer-Frateur培养基上生长。
2.2.4.3 生理生化实验[46]⑴接触酶的试验：在长势旺盛的平板上，滴加3%的H2O2，观察有无气泡产生。
⑵以铵盐为唯一氮源的生长试验：观察在培养基2.2.2中⑺中生长情况。
⑶GYC培养基产色素试验：观察在培养基2.2.2中⑻上能否生成棕色的水溶性色素。
⑷生酮试验(甘油生成二羟丙酮的试验)：在培养基2.2.2中⑽上，将费林液注满平板，观察菌落周围是否有红色沉淀出现。
⑸产5-酮基葡萄糖酸盐试验：在培养基2.2.2中⑾上，32℃培养24 h后，观察菌落周围是否有白色不透圈。
⑹葡萄糖产酸试验：观察培养基指示剂是否变色。
⑺产纤维素试验：在含糖培养基上向菌落上滴加Lugol碘液和60%硫酸液，观察菌落周围变化情况。
⑻氧化乙酸的能力试验：在培养基2.2.2中⑿上，32℃培养48 h，观察菌落周围是否出现乳白色的晕圈。
⑼氧化乳酸的力试验：在培养基2.2.2中⒀上，32℃培养48 h，观察菌落周是否出现乳白色的晕圈。
⑽在以乙醇为唯一碳源的培养基上，观察其能否生长。
2.2.5 发酵条件实验⑴发酵温度单因素实验以培养温度为梯度，26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，将筛选所得的菌种，分别接种于装有100mL醋酸菌发酵培养基的500mL三角瓶中，置于180r/min的恒温摇床培养72h，以产酸量和醋酸菌数来确定最佳生长条件。
⑵将筛选所得的菌种，分别接种于分离平板上，观察出现透明圈的时间，确定最快产酸时间。
2.3结果与分析2.3.1 分离筛选⑴分离纯化：从分离平板中挑选出107个单菌落菌株。
⑵初步筛选：通过醋酸菌分离培养基筛选，选出44个单菌落产酸菌株。
⑶复筛：又经革兰氏染色和醋酸定性试验，淘汰了革兰阳性及不产醋酸的菌株，选出4株醋酸菌株。
⑷产酸定量试验，筛选出产酸量大最快的菌株，结果见下图2.3.2.A图2.3.1.A 4株醋酸菌产酸量测定Fig 2.3.1.A Four strains in determination of acid acetic acid bacteria⑸耐酒精能力试验，筛选出耐酒精性能好菌株，结果见下图2.3.2.B图2.3.1.B 4株醋酸菌耐酒精测定Fig 2.3.1.B 4 of acetic acid bacteria resistant to alcohol determination⑹然后继续对2株性能较好菌株进行传代培养，确定其传代的稳定性。
每一代产酸量见下表2.3.1.a。
表2.3.1.a 4珠醋酸菌传代培养每代产醋酸的测定(g/L)Tab 2.3.1.a 4 strains acetic acid bacteria in each generation nestin)cultivating the determination of acetate(g/L)菌株号X1 X2 X3 X41代38.2 30.9 31.3 41.82代39.4 31.5 31.5 43.43代38.3 30.4 30.1 42.34代37.4 27.3 26.3 40.65代35.1 27.9 22.7 38.76代30.6 24.1 19.5 36.97代28.4 21.8 14.7 35.5由表2.3.1.a可以看出，每代发酵培养中，菌株X4的醋酸产量最高，并在传代培养过程中产量稳定，故选该菌株为目的菌株。
⑺存活期限试验：把X4菌株接入三种斜面保藏培养基，每隔三个月接种到各方法所用的培养基上。
观察其存活情况，见表2.3.1.b：表2.3.1.b三种方法保藏醋酸菌的存活时间Tab 2.3.1.b Three methods of acetic acid bacteria survival time of biomaterial时间/月 3 6 9 12 15 18 21 24 斜面法﹢﹣液体法﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹣改进斜面﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢注：“+”表示生长；“++”表示生长良好；”﹣”表示不生长。
从2.3.1.b看可以出，普通斜面保减法保藏的保藏时间小于3个月；而液体保藏法的保藏时间大于18个月；但改进后的斜面液体保藏法，能在20个月内都保持生长良好，且保藏的时间可达24个月。
醋酸菌所产的酸，是造成醋酸菌保藏时间受到限制的原因之一。
随着保藏时间的延长，尽管醋酸菌能抵抗一定的酸，但一直处在酸性环境中，醋酸菌会被自己产的酸所杀灭。
因此，在菌种生长的很健壮后又加入碳酸钙和液体培养基，既降低了氧气的含量，又中和了产生的醋酸，使其在生长和保护方面较液体保藏更加先进了一步，保藏效果也更好。
2.3.2 分析鉴定结果2.3.2.1菌株X4形态特征显微镜下细胞呈椭圆或短杆状，无芽孢，单个或成对、成链排列。
2.3.2.2X4培养特征X4在基础平板培养基上生长旺盛，形成灰白色圆形菌落，表面光滑、凸起，边缘整齐，培养48h能产酸，使CaCO3溶解形成明显的透明圈。