LB
RB
E
Ti Plasmid
Vir 区
Con 区
Ori 区
T-DNA的结构与功 能∶
左边界 核心区 右边界
LLBB RRB
B
Vir 区操纵子的基因结构与功能
• Vir区是一段长度为35KB操纵 子
• 包含六个基因： VirA、VirB 、 VirC 、 VirD 、 VirE 、 VirG。
植物遗传转化的载体系统
表型分析鉴定
鉴定步骤： 筛选鉴定（利用质粒上的选择标记） 报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）
2.2.1 外源DNA导入植物细胞的方法
• 载体介导的转化方法： 致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 病毒介导的基因转移
• DNA直接导入法： 化学法：PEG诱导的基因转化 电激法介导 显微注射
• 媒体介导法 脂质体介导 超声波介导 基因枪介导
致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法
含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细 胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以 导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其 复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载 体， 与含目的片段的DNA片段重组，导入 致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养 法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入 植物细胞。
②氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicol acetyltransferase, CAT）基因
③潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase, Hpt）基因
④β – 葡萄糖酸苷酶 （β – Glucuronidase, GUS）基因
⑤荧光素酶（Luceferase, Luc）基因 ⑥抗除草剂（Basta, Bar）基因
电激法介导：
利用高压脉冲
＋
作用，在原生质体
－
上形成可逆的瞬间
＋
－
通道，从而促进外
＋
－
源DNA的摄取。
＋
－
＋
－
＋
－
＋
－
2.2.2 转基因操作的受体系统
高频再生体系的建立： • 愈伤组织再生系统 • 直接分化再生系统 • 原生质体再生系统 • 胚状体再生系统 • 生殖细胞再生系统
抗生素敏感实验： 抑制细菌生长 杀死非转化细胞
2.1 DNA重组技术 将外源DNA片段与载体分子连接，形
成重组DNA分子，再将重组子导入寄主细 胞内。这一技术体系称为DNA重组技术。
DNA 重 组 技 术
2.1.1 目的基因的分离（或合成）
➢ 常用的几种目的基因： ➢ 基因工程的工具酶:
限制性内切酶（restriction endonuclease) DNA连接酶（ligase) 末端修饰酶
• Ti质粒
根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为 共价闭合环状的DNA分子。
• Ti质粒的功能 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成激素的能力； 诱发植物产生冠瘿瘤； 赋予寄主分解冠瘿碱的能力； 决定寄主范围。
• Ti质粒的结构 T-DNA区 Vir 区 Con 区 Ori 区
T-DNA 区
PEG诱导的基因转化
聚乙二醇（PEG）、多聚鸟苷酸、磷 酸钙在高PH值条件下诱导原生质体扑获 DNA分子。
步骤： 共保温； 稀释PEG； 非选择培养； 选择培养。
优点： 转化顺利，对细胞伤害小； 避免嵌合体的生成； 易于选择； 便于进行理论研究； 受体广泛。
脂质体介导：
用化学物质将 DNA包裹成球体， 通过植物原生质体的 吞噬作用，把DNA 导入细胞。
一元载体（顺势载体） 双元载体（反式载体）
农杆菌介导的转化质粒的构建
目的基因
报告基因，选择标记基因
Ampr P
G1
T
LB
P
G2
T NOS
RB
Vir区
农杆菌导入方法
• 共培养法 • 叶盘转化法 • 整株感染法 • 原生质体共培养法
基因枪介导的转基因操作：
基本原理 操作步骤 优点 影响转化效率的因素
2.1.2 基因工程的载体系统
质粒载体 噬菌体载体 病毒载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
载体
植物基因工程的报告基因：
• 定义: • 特点:
在选择培养基上生长 报告基因与目的基因嵌和表达 研究调控区
报告基因的种类:
①新霉素磷酸转移酶（ Neomycine phosphotransferase – II, NPT II)基因
基因工程的基本概念
转化（Transformation)：是指将外源 DNA导入受体细胞的过程。 复制子（Replicon)：具有一个复制起点 (ori) 的DNA分子称为一个复制子。 载体（Vector）：能与外源DNA连接并实 现转化的复制子。 重组子（Recombinant）：连接了外源 DNA分子的复制子。
操作步骤： 预培养 转基因操作 转基因植株筛选和培养 转基因植株的鉴定 田间释放
影响转化效率的因素： 金属微粒 DNA沉淀辅助剂 DNA纯度和浓度 微弹速度 植物材料
基因枪法的优点： 无宿主限制； 靶受体类型广泛； 可控度高； 操作简便。
问题： 转化效率低； 嵌合体多； 稳定性差，瞬时表达； 外源基因沉默； 整合机理不详。
第十七章 分子育种
1. 分子育种的概念与程序
1.1 概念 按照人们的愿望，进行严密的设计，通
过体外 DNA重组技术 和 DNA转移技术， 有目的地改造生物种性，使现有物种在短时 间内趣于完善，以创造出新的生物类型的技 术体系 ，亦即基因工程。
1.2 植物基因工程
植物基因工程是近20年来随着DNA重 组技术、植物遗传转化技术及植物组织培 养技术而发展起来的现代生物技术。
1.3 基因工程的基本步骤 目的基因的获取 基因载体的选择与构建 目的基因与载体的拼接
重组子导入受体分子
重组的目的基因
①观赏性:开花、花色、花型、花径相关基因。 ②抗逆性:抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因 ③切花寿命 ④花期调控
2. 基本技术及原理
农杆菌敏感实验：
2.3 转化细胞的培养和转基因植株的再生
• 恢复生长 • 筛选培养 • 植株再生
2.4 转基因植物的鉴定
遗传鉴定
直接鉴定DNA分子是否整 合到基因组上。 1）扩增目的片段； 2）杂交信号鉴定。 （Southern 杂交）
表达鉴定
利用报告基因 Northern 杂交 Western 杂交