3. 培养温度的选择
离体培养的花药(花粉)在培养初期对温度比较 敏感，大多需要在25〜28°C下培养
4. 生长调节物质的选择
• 在花药和花粉培养的脱分化阶段，生长调节物质 的选择是最重要的坏节。
• 花药和花粉培养的主要内容是生长调节物质的筛 选，包括生长调节物质的种类、浓度及配比。生 长调节物质的选择，主要根据植物种类和植株再 生方式来进行。
5. 碳源的选择
碳源的选择包括碳源浓度和各类的选择，以适应不同 植物种类离体花药和花粉小孢子脱分化过程中对渗透和异 养能源物质的要求。
一般来说，单子叶植物比双子叶植物要求更高浓度的 碳源，前者一般5%以上，高者可达到15%，后者一般3% 左右。
大多数情况下，采用蔗糖作为碳源都可获得较好的结 果，但采用其他糖作为碳源可或多或少提高培养的效果。
（一）花药和花粉植株的倍性
1. 由花药和花粉培养获得的植株，倍性多样。 2.花药植株倍性混杂的原因： ①体细胞组织的干扰。 ②生殖细胞的自发加倍
（二）花药和花粉植株倍性鉴定
1. 形态鉴定 （1） 一般情况下，单倍体植株的形态为植株瘦
弱、叶片窄小、花小柱头长，而多倍体植物的形态 为植株健壮、叶片宽大、花大柱头短
（三）外植体制备
花药和花粉培养中的表面灭菌通常先用70%－75% 乙醇浸润花蕾30s左右，然后在孢和漂白粉溶液(上清 液)中浸泡10-20min，或在0.1%氯化汞溶液中处理510min，之后用无菌水漂洗3-5次。由于花药和花粉 粉培养所取材料是未开放的花蕾，其内部的花和花粉 实际上处于无菌状态，表面灭菌在能杀灭花蕾表面微 生物的前提下，处理的强度以尽可能轻为好。花蕾经 表面灭菌后，需在无菌条件下录取花药，接种在培养 基上。
第四节 植物花药和花粉培养
花药培养和花粉培养： 指离体培养花药和花粉，使花粉改变原来的配子体
发育途径，转向孢子体体发育途径，形成花粉胚或花粉 愈伤组织，最后形成花粉植株从中鉴定出单倍体植株并 使之二倍化的细胞工程技术
单倍体的应用潜力
①克服后代分离，缩短育种年限； ②选择效率高； ③有利于隐性基因控制性状的选择； ④快速获得纯合自交系； ⑤其他：复壮；远缘杂交；进行花粉发育等的 理论研究。
• 花粉培养来说，需制备花粉外植体： ①自然释放法。 ②研磨过滤收集法。 ③机械游离法。 ④磁拌法。
二、植株再分化 （一）脱分化培养
1. 培养方式的选择 2. 基本培养基的选择 3. 培养温度的选择 4. 生长调节物质的选择 5. 碳源的选择 6. 其他添加成分
1. 培养方式的选择
（1）固体平板培养：固体培养基上进行培养 （2）液体培养：在液体培养基表面进行培养 （3）双层培养 ：在固体——液体双层培养基进行
一、培养材料的选取与制备
（一）材料选择 （二）预处理 （三）外植体制备
（一）材料选择
1. 基因型：培养材料的基因型是影响花药培养诱 导单倍体成功的最重要因素之一。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2. 花粉发育时期 3. 生理状态
（二）预处理
1. 低温处理：将花蕾用湿纱布包裹后再用塑料 袋封装，放在冰箱中冷藏
2. 高温处理（热激处理） 3. 高温和低温交替处理 4. 黑暗处理 5. 高糖液处理 6. 激光照射 7. 其他方法
1. 胚状体途径
（1）通过胚状体途径再生植株的，都是那些很容易做 花药(花粉)培养的基因型或从极佳生理状态的母株上 取到的处于最适宜发育时期的花药(花粉)
（2）对于直接胚状体途径来说再分化培养一般只是将 完成了诱导脱分化的花药和花粉进行转管培养。在少 数情况下，转管培养所用的培养基成分和培养方式可 以和脱分化培养阶段完全相同，多数情况下，这种转 管培养要做有别于脱分化培养阶段的适当调整
6. 其他添加成分
（1）活性炭 （2）水解酪蛋白 （3）维生素C （4）维生素A （5）聚乙烯吡哆酮 （6）硝酸银 （7）三十烷醇
（三）再分化培养
1. 胚状体途径 （1）直接胚状体发生：从离体培养的花药和花粉
直接产生胚状体 （2）间接胚状体发生：离体培养的花药和花粉先
形成胚性愈伤组织，然后再由胚性愈伤组织分 化出胚状体 2. 器官发生途径
培养 （4）分步培养：花药-花粉分步培养 （5）条件培养：用预先培养过花药的液体条件培
养基再次进行花药培养
（6）看护培养：
（7）微室培养
2. 基本培养基的选择
（1）常用的培养基有MS、Nitsch、B5、N6、H、 Miller培养基等
（2）基本培养基的影响实质上是无机盐离子浓度、 氮源总浓度、铵态氮和硝态氮的浓度和比值等差 异造成的
3. 染色体数目鉴定 采用涂片法(或压片法)和去壁低渗法，通过检
查根尖或茎尖染色体数目，排除嵌合体的干扰， 可同时对根尖以外的细胞，如嫩叶细胞、花粉母 细胞等的染色体进行观察。
4. 遗传标记鉴定 （1）生化标记鉴定：以基因表达产物蛋白质为主
的一类标记系统，常用的是同工酶标记。 （2）分子标记鉴定：标记检测的是植物基因组
2. 器官发生途径
通过器官发生型途径再生植株的分化培养中. 最重要的是选择适宜的生长调节物质类、浓度和 配比。生长素和细胞分裂素共同作用调控愈伤组 织形态发生的模式可以用来指导花药和花粉培养 中愈伤组织分化器官的培养。
（四）炼苗和移栽
三、单倍体植株鉴定和染色体加倍
（一）花药和花粉植株的倍性 （二）花药和花粉植株倍性鉴定 （三）花药和花粉单倍体植株的染色体加倍
（2）显微镜下观察叶片气孔保卫细胞的长度，是 近年来采用较多的细胞倍性鉴定法。一般情况下， 倍性越高气孔越大，单位面积气孔数目越小。
2. 结实性鉴定 单倍体植株、三部体植株和非整体植株虽然
都能开花但不结实；二倍体植株则开花结实都正 常；四倍体植株虽能开花和结实，结实性不良， 但经过长期选择淘汰，其结实性可能提高。
DNA水平的差异
5. 流式细胞仪鉴定法
（三）花药和花粉单倍体植株的染色体 加倍
1. 在常规条件下处理 用0.02%〜0.4%秋水仙素处理花药和花粉单倍体
植株 2. 在组织培养条件下处理
用秋水仙素加倍也可在组织培养条件下进行。常用 的方法有两种：一是在培养基中加入秋水仙素进行培 养；二是在培养过程中单独用秋水仙素溶液浸泡培养 材料，然后置于不含秋水仙素的培养基中培养。