细胞培养实验和Western Blot实验报告
姓名：张人龙学号：YX16100508115 专业：中医骨伤科学
实验一：细胞培养
1.实验目的
初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。

2.实验原理
从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。

细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。

近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。

细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。

直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。

所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。

3.实验用品
3.1 材料和标本乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)
3.2 器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

2.3 试剂含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。

4.实验方法
4.1 原代细胞培养
4.1.1 原理
细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。

由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。

原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。

一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

4.1.2 操作
①．取材
用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。

然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。

置于无菌平皿中。

②．切割
用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。

移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

③．消化、接种培养
吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

4.1.3 结果
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。

4.2 传代细胞培养
4.2.1 原理
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。

培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。

在一代中，细胞培增3～6次。

细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。

常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。

一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。

细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

4.2.2 操作
①．将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。

(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。

②.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即
在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。

③．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml
左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。

4.2.3 结果
一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。

4.3 器材及液体的准备和无菌操作的注意事项
4.3.1 器材和液体的准备
细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。

4.3.2 无菌操作中的注意事项
在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。

为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。

操作前20～30分钟起动超净台吹风。

操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。

培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。

操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。

使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。

总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。

实验二：Western Blot实验
2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
2 、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。

定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
3 、电泳分离蛋白质
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。

常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。

各种膜的技术参数及比较如下：
去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。

常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
6 、一抗孵育
一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：
选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）
选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）
选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
一抗的保存和使用：
根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。

抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。

由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。

如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。

孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别
内参的选择和使用：WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准！
7 、二抗孵育
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。

如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。

孵育条件一般为室温1-2小时
8 、底物孵育
选择显色或者化学发光底物。

一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量
9 、结果分析和检测
凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片。