《生物化学实验》课程教学大纲【课程编号】【英文名称】Experiments of Biochemistry【课程学时】48【适用专业】生物技术、生物工程一、本实验课程的教学目的和课程性质生物化学实验是生物技术和生物工程专业学生的必修专业基础课，是一门理论性和实用性很强的课程。
本实验课程的教学目的是通过对实验室基本操作规范、大分子物质性质鉴定、比色测定、大分子物质的分离和提纯、电泳分离等方面的理论和实践教学进一步加深和巩固学生对生物化学理论知识的学习，培养学生的实验技能，有效地提高学生的动手能力，为今后的科研工作打下基础。
二、本实验课程的基本要求通过生物化学实验的教学，使学生达到如下要求：1.在实验过程中将生物化学的理论知识进一步验证、巩固、扩充和提高。
2.学会正确使用有关生化仪器，了解和掌握生化实验室的基本操作规范。
3.培养学生在进行生物学实验时的实验过程、结果分析、实验设计和动手实验的能力，培养和提高学生的实验操作技能。
4.掌握包括蛋白质、核酸、酶、维生素、脂类和代谢各方面实验方法和技能，掌握离心、滴定、比色、层析、电泳等各种生物化学实验技术。
5.培养学生学习兴趣、重视实践、探索进取、吃苦耐劳、团结合作的精神。
6.培养科研能力和科学素质，使学生具有严格的科学学风和发现、分析、解决问题的初步能力。
三、本实验课程与其它课程的关系本实验课程上承《无机化学实验》、《分析化学实验》和《有机化学实验》，下续《植物生理学实验》、《遗传学实验》、《分子生物学实验》等课程，因此生物化学实验的学习是学生进行其他生物学实验的前奏，是今后开展生物学方面实验和研究的基础。
四、实验课程理论教学内容安排（共安排6学时）第一部分生物化学实验室的基本操作规范（1.0学时）【目的要求】1、了解实验的生物学性质和化学性质。
2、了解实验室的基本操作规范和实验误差的控制。
3、了解生物样品的制备方法。
【教学内容】了解生物化学实验的基本操作规范及准确测定的方法。
第一节实验室基本操作规范第二节准确测量的方法第三节普通生物样品的制备方法【教学重点】掌握减少误差提高实验准确性的方法。
【教学难点】如何减少实验误差提高实验准确性。
第二部分层析法的原理与方法（1.5学时）【目的要求】1、掌握层析法的原理。
2、了解层析法的种类。
3、运用层析法分离化合物。
【教学内容】通过纸层析法分离氨基酸掌握层析法的原理与方法。
第一节层析法的基本原理第二节几种常用的层析法第三节纸层析法分离氨基酸【教学重点】掌握层析法的基本原理。
【教学难点】如何针对不同的物质分离采用不同的层析法。
第三部分比色测定原理与方法（1.5学时）【目的要求】1、了解分光光度计的使用。
2、熟悉实验结果的处理。
3、掌握比色测定的方法与原理。
【教学内容】通过总糖的测定、可溶性蛋白含量的测定、小麦萌发前后淀粉酶活性的比较，掌握比色测定的方法与原理。
第一节比色测定的原理第二节分光光度计的正确使用第三节实验结果的处理方法【教学重点】掌握比色测定的原理及分光光度计的使用方法。
【教学难点】如何减小比色测定的误差及实验结果的处理。
第四部分电泳的原理与方法（2学时）【目的要求】1、了解电泳技术的基本原理2、掌握电泳过程中的关键步骤。
3、掌握实验结果的分析。
【教学内容】通过醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可溶性蛋白的实验来讲解电泳技术的基本原理，电泳的种类及基本操作步骤。
第一节电泳技术基本原理第二节电泳的种类第三节电泳技术的基本操作步骤【教学重点】掌握电泳技术的基本原理。
【教学难点】电泳技术中的关键步骤。
五、实验内容安排2、实验项目说明实验一、糖类的性质实验【目的要求】了解糖类的某些颜色反应的原理，学习应用糖的颜色反应来鉴别糖类的方法，学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法。
【内容】糖类的颜色反应：α-萘酚反应：糖在无机酸作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与α-萘酚生成紫红色物质。
间苯二酚反应：在酸的作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚反应生成红色物质，此反应是酮糖的特异反应。
糖类的还原反应：一些糖类分子中含有的醛基或酮基，在碱性溶液中能够将铜、铁、银等金属离子还原，同时本身被氧化成糖酸及其它产物。
斐林试剂与本尼迪克特试剂能够将硫酸铜里的Cu2+还原成红色或黄色的Cu2O。
【方法】α-萘酚反应、间苯二酚反应、斐林试剂与本尼迪克特试剂。
实验二、总糖的测定【目的要求】学习蒽酮比色定糖法的原理和方法，学习分光光度计的原理与方法。
【内容】糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糠醛衍生物后与蒽酮缩合成蓝色化合物，溶液的含糖量在150µg以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。
【方法】蒽酮比色法实验三、粗脂肪的提取和测定【目的要求】学习和掌握用索氏提取器提取脂肪的原理和方法，学习和掌握重量分析法对粗脂肪进行定量测定。
【内容】利用脂类物质溶于有机溶剂的特性，在索氏提取器中用有机溶剂对样品中的脂类物质进行提取，因提取的物质是脂类混合物故称为粗脂肪。
将样品抽提出的粗脂肪，蒸去溶剂，干燥，称重，按公式求出样品中的粗脂肪含量。
【方法】索氏提取法、重量分析法。
实验四、脂肪碘值的测定【目的要求】学习测定脂肪碘值的原理和方法。
【内容】碘值是指100g脂肪在一定条件下吸收碘的克数。
碘或氯化碘、溴化碘等可以与脂肪中不饱和脂肪酸的双键发生加层反应，脂肪酸的不饱和程度越高，与不饱和脂肪酸发生加层反应的碘量就越多，脂肪的碘值就越高，本实验用一定量（过量）的溴化碘和待测的脂肪作用后，用硫代硫酸钠滴定的方法测定剩余的溴化碘量，最后计算出待测脂肪吸收的碘量，求得脂肪的碘值。
【方法】硫代硫酸钠滴定法实验五、总氮量的测定－凯氏定氮法【目的要求】学习和掌握凯氏定氮法的原理和基本操作。
【内容】含氮有机物与浓硫酸共热时其中的碳、氢元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与浓硫酸作用生成硫酸铵。
浓碱可以使消化液中的硫酸铵分解、游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准的无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准盐酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。
【方法】凯氏定氮法、微量滴定法实验六、氨基酸的分离鉴定－纸层析法【目的要求】通过氨基酸的分离，学习纸层析法的原理和基本操作。
【内容】纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：Rf＝原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。
在一段条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本实验运用纸层析法分离氨基酸。
【方法】纸层析法实验七、蛋白质的性质实验－蛋白质及氨基酸的呈色反应【目的要求】了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式，了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理，学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
【内容】蛋白质的呈色反应：1、双缩脲反应：尿素加热到180度左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似也能够发生类似反应，因而可以用于蛋白质的定性或定量测定。
2、茚三酮反应：出脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α－氨基酸及一切蛋白质都能够和茚三酮反应生成蓝色物质。
该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
3、黄色反应：含有苯环结构的氨基酸遇硝酸后可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
4、考马斯亮蓝反应：考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
它的染色灵敏度高，反应速度块，在0.01-1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。
所以常用来测定蛋白质的含量。
【方法】双缩脲反应，茚三酮反应，黄色反应与考马斯亮兰反应实验八、甲醛滴定法测定氨基酸【目的要求】学习掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点【内容】氨基酸是两性电解质，在水溶液中是弱酸，完全解离时的pH为11～12或更高，若用碱滴定，一般指示剂的变色域小于10，很难准确指示滴定终点，甲醛能够与氨基酸的氨基结合，使溶液的酸度增加，可以使滴定终点移至酚酞的变色域内（pH9左右），因此可以用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定来定量测定氨基酸的含量。
【方法】甲醛滴定法实验九、酶的特性【目的要求】了解和加深对酶的性质的认识。
【内容】包括温度对唾液淀粉酶活力的影响；pH对唾液淀粉酶活力的影响；唾液淀粉酶的激活剂及抑制剂；唾液淀粉酶的专一性等4组实验。
【方法】观察酶催化的显色反应的变化实验十、底物浓度对酶促反应速度的影响---米氏常数的测定【目的要求】了解底物浓度对酶促反应速度的影响，学习测定米氏常数(Km)的原理和方法。
【内容】本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Lineweaver－Burk双倒数作图法测定Km值。
胰蛋白酶能够催化蛋白质中的碱性氨基酸的羧基所形成的肽键水解，水解生成的自由氨基可用甲醛滴定法检测，因此用甲醛滴定法检测自由氨基酸的变化就可以追踪反应。
【方法】Lineweaver－Burk双倒数作图法实验十一、核酸的分离与鉴定【目的要求】初步掌握DNA和RNA的分离方法和定性鉴定。
【内容】用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸在低温下抽提材料匀浆，以除去酸溶性小分子物质，再用有机溶剂如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。
最后用浓盐溶液（10％氯化钠溶液）和0.5mol/L高氯酸（70℃）分别提取DNA 和RNA，再进行定性鉴定。
由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测定核酸。
【方法】提取DNA和RNA并进行定性鉴定。
实验十二、种子萌发前后淀粉酶活性的比较【目的要求】学习分光光度计的原理和使用方法，学习测定淀粉酶活力的方法，了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。
【内容】种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。
淀粉酶能够使淀粉分解为麦芽糖。
麦芽糖具有还原性，能够使3,5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水杨酸。
后者可用分光光度计法测定。
休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌发后酶活力逐渐增强，并随发芽的天数的增长而增加。
本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。
【方法】3,5-二硝基水杨酸比色法实验十三、醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白【目的要求】了解电泳的基本原理，学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的基本操作技术。