实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）
一、实验原理
脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。

反应式： (NH 2)2CO+ H 2
O 脲酶
2NH 3 + CO 2
氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。

反应式：
NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤
将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：
取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。

按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1
H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。

三、结果计算
脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂
1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。

2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷
酸盐缓冲液适当稀释。

3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。

4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.2
5 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。

5 、1 mol·L -1 H
2SO
4
溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容
量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。

6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。

此溶液含NH3为40μmol·mL-1。

7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。

向此液中加70 mL30% KOH ，不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。

混匀，静置过夜，倾出清液贮于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。

在有碘化汞情况下，可溶10 g HgI2和7 g KI于少量蒸馏水中，另溶16 gNaOH 于50mL 水中，待冷却后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水定容至100 mL 。

过夜澄清后，倾出上清液存于棕色试剂瓶中。

（配置方法之二）。