2、纯化大肠杆菌
微生物的接种技术
接种方法有： 平板划线法 稀释涂布平板法
平板划线法：
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将 聚集的菌种逐步 到培养基表面。 其操作步骤是： ①将 在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。 ②在酒精灯火焰旁 接种环，并打开大肠杆菌的菌种 试管的棉塞。 ③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口 的目的。 ④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环 。 ⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。 ⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划 3～5条 线，盖上皿盖，不要划破培养基。 ⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线 开始向第二区 域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线 。注意不要将第五区的划线与第 区划线相连。 ⑧将平板 放在培养箱中培养。
6、培养
恒温37℃培养
稀释涂布平板法




将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液 分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍 数足够高时，即可获得单个细菌形成的菌落。 系列稀释操作： ①取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103 、104、105、106。 ②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试 管中，并吹吸3次，使之混匀。 ③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内 吹打均匀，获得102倍液。依此类推。 注意：操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处 。整个操作过程中使用了1支移液管。
灭菌方法：


（1）接种环、接种针、试管口等使用 （2）玻璃器皿、金属用具等使用 器械是 干热灭菌箱 ； （3）培养基、无菌水等使用 器械是 高压蒸汽灭菌锅 。
灭菌法； 灭菌法，所用 灭菌法，所用
灭菌方法：


（1）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法； （2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法，所用 器械是 干热灭菌箱 ； （3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用 器械是 高压蒸汽灭菌锅 。
(2)灭菌的方法：
1、灼烧灭菌 2、干热灭菌： 160-170 ℃下加 热1-2h。 3、高压蒸气灭菌： 100kPa、121 ℃ 下维持15-30m来防止实验室的培养物 被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被 微生物感染。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却 后再进行划线？ 答：避免接种环温度太高杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为 什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线 条起始处要少，每次从上一次划线的末端开 始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而 逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来 的菌落。
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物 污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固 后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置， 既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅 在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来 培养微生物吗？为什么？ 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之 间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板 培养微生物。
阅读“无菌技术”，回答下列问题：



获得纯净培养物的关键是 防止外来杂菌的入侵 。 无菌技术包括： （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清 洁和消毒 ； （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具 进行 灭菌 ； （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精 灯火焰附近 旁进行； （4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接 触。











平板划线法：
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将 聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 其操作步骤是： ①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。 ②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种 试管的棉塞。 ③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。 ④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。 ⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。 ⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划 3～5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。 ⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区 域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线 。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。 ⑧将平板倒置放在培养箱中培养。
一、基础知识：
（一）培养基 培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专 供 微生物 生长繁殖使用的混合营养液。
1.培养基的类型 培养基可分为固体培养基和液体培养基。琼脂作 凝固剂 2.不管哪种培养基， 一般都含有 水 、 碳 源、和 氮源、 无机盐 等营养物质， 另外还需要满足微生物生长对 、 营养物质,例 pH 特殊 如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合 物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) 以及、 氧气 等的要求。
P20结果分析与评价
1、培养未接种培养基的作用是对照，若有菌 落形成，说明培养基灭菌不彻底。 2、大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光 泽，边缘整齐。 3、培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、 不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。 原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落 体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。 4、在某培养基上出现了3种特征不同的菌落 ，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。
1.制备牛肉膏蛋白胨培养基
碳源、氮源、磷酸盐和维生素 氮源和维生素 无机盐 凝固剂
阅读“无菌技术”，回答下列问题：



获得纯净培养物的关键是 。 无菌技术包括： （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清 洁和 ； （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具 进行 ； （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精 灯 旁进行； （4）避免已灭菌处理的材料用具与 相 接触。

消毒方法：

（1）日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法； 100℃ 煮沸5-6min （2）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏 消毒法 70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min （3）对接种室、接种箱或超净工作台 首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增强消毒效果 ，然后使用 紫外线 进行物理消毒。 （4）实验操作者的双手使用 75%酒精 进行消毒； （5）饮水水源用 氯气 进行消毒。











接种、划线
灼烧接种环→ 取菌液→ 划线分离→

烧至暗红
接种、划线
灼烧接种环→ 取菌液→ 划线分离→

菌液膜
接种、划线
划线分离
•倒置后做好标记，写在培养皿侧面
P18问题讨论
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之 前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然 需要灼烧接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接 种环上可能存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束 后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种 环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通 过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐 渐减少，以便得到菌落。 划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残 留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制





1 计算：根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量。 2 称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速， 目的是防止牛肉膏蛋白胨吸潮。 3 溶化：①加水加热溶化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加 热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻 棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 4 调pH：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。 5 灭菌： 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌 锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。 6 倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进 行。 其过程是： ①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞； ②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰； ③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻 盖上皿盖。 ④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
（二）无菌技术
条件
较为温和 的物理或 化学方法
结果
仅杀死物体表面 或内部一部分对 人体有害的微生 物，不包括芽孢 和孢子
常用的方法
煮沸消毒法、巴氏 消毒法、紫外线或 化学药物消毒法
消毒
灭菌
强烈的 理化因 素
杀死物体内外所 有的微生物，包 括芽孢和孢子
灼烧灭菌、干热灭 菌、高压蒸汽灭菌
消毒方法：
（1）日常生活经常用到的是 消毒法； 100℃煮沸5-6min （2）对一些不耐高温的液体，则使用 消毒法70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮 15min （3）对接种室、接种箱或超净工作台 首先喷洒 等溶液以增强消毒效果 ，然后使用 进行物理消毒。 （4）实验操作者的双手使用 进行 消毒； （5）饮水水源用 进行消毒。

稀释！ 平板划线法是通过划线进行稀释，而稀释平板涂布 法是通过稀释培养液达到稀释的目的。
大肠杆菌的纯化培养
1 、牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制
（1）计算（2）称量 （3）溶化 （4）灭菌 （5）倒平板
2 、纯化大肠杆菌
（1）平板划线法
（2）稀释涂布平板法
1.制备牛肉膏蛋白胨培养基
碳源、氮源、磷酸盐和维生素 氮源和维生素 无机盐 凝固剂
配制培养基
市场常见琼脂条
包器材
包器材
灭菌
条件： 121℃、100kPa 20-30min