制备小鼠骨髓来源巨噬细胞
一、材料
1.6-9周小鼠（GFP+小鼠、野生型小鼠）
2.配制培养液：RPMI 1640培养液+1×GlutaMax（Gibco）+10%FBS（热失活）
3.盐溶液：0.9%氯化钠溶液（无菌），储存于4度。

4.纯化的重组M-CSF（CSF-1）：到货后灭菌PCR管分装。

5.消毒后的手术器械。

6.70%乙醇溶液。

7.27G针头
8.20ml注射器
9.低绒纸巾
10.100mm培养皿
11.3个50ml离心管
二、方法
1.复温培养液（预添加M-CSF）至37摄氏度。

2.处死小鼠，喷洒70%乙醇溶液消毒。

拉扯双侧后腿直至听到清脆响声（提示股骨从
髋骨脱臼）。

3.使用干净的剪刀、镊子沿一侧大腿环形剪开皮肤，向爪子方向剥离皮肤。

4.用镊子将腿部肌肉分开，露出股骨和胫骨（注意不要损伤骨头）。

5.切断股骨与髋骨间的韧带，切下膝关节以下的骨头。

将股骨和胫骨至于冰冷的盐溶
液中。

6.同法处理另一只腿。

7.用低绒纸巾小心剥除骨骼上附着的组织，将骨头置入70%乙醇溶液中。

8.20ml无菌注射器吸满预热的培养液（无添加M-CSF），装上27G针头。

并准备好50ml
离心管。

9.从膝关节处分离股骨和胫骨，丢弃膝盖骨。

一个无菌镊夹住股骨，用一把无菌剪刀
剪掉股骨上端。

将针头插入骨髓腔，用培养液反复冲洗，将骨髓冲入50ml离心管。

冲洗过程中，上下移动针头刮扫骨髓腔。

每根骨头使用大约5ml培养液。

丢弃骨头。

10.同法处理胫骨（剪掉上下两端）。

11.将细胞悬液离心（150g，5分钟）。

丢弃上清，加入培养液（添加M-CSF）。

混匀细
胞悬液。

12.每根骨头准备两个100mm培养皿。

将细胞悬液打入培养皿，添加预热培养液（添
加M-CSF）至10ml。

13.置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱内培养5天。

14.第5天，使用室温盐溶液5ml冲洗培养皿（巨噬细胞为贴壁生长）。

使用细胞刮刀
刮下贴壁细胞，转移入离心管，150g离心5分钟。

分离的细胞建议2天内使用。

关于M-CSF的工作浓度：介于1ng/ml到1ug/ml之间。

设定浓度梯度培养：如1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 1ug/ml，或倍比稀释。

按上述方法培养5日后，细胞计数5×107/培养皿为最合适M-CSF工作浓度。