Solexa 的测序技术可以同时分析数亿个单个 D N A 单链分子的序 列 ,从而能够对个体进行完整的基因分型
3、ABI/SOLID连接酶测序技术：
也被称作为连接测序 (sequenceing byli微珠上,并通过乳液PCR进行扩增;然后将含有扩增后片段的 微珠以阵列的方式排布,再加入测序引物,与固定在每个微珠上的DNA片段中已知的起始 序列发生结合。随后,向混合物中加入长度为8个碱基的荧光标记寡核苷酸探针。这些探 针从3 ′ 端开始的第5个碱基为查询碱基 , 分别用 4 种不同的荧光标记表示A、G、T 或 者C,共分为 4 组。如果一条带有正确互补序列的探针与DNA发生结合,DNA连接酶将把它 与测序引物进行连接 , 使得它被固定在表面上,而其他结合得不够牢固的探针分子都会 被洗去。接着 ,用激光来激发探针上的荧光标记分子 ,从而获得新结合上碱基的信息。 最后, 将探针剩余部分和荧光标记切除 。在新一轮的测序过程开始时 ,重复连接、荧光 检测和切除步骤 , 得到第 10 个碱基的信息。类似地 在第三轮中可以获取第15个碱基,第 四轮中获取第 20个碱基 , 依此类推。
原理: 利用合成测序理论，将样本DNA的单链分子绑定在该仪器特有的没有背景荧 光的玻璃表面，通过加入荧光标记的核苷酸和聚合酶到单分子阵列中，核苷酸会特异 性结合到DNA分子的结合位点上 通过激光激发结合在DNA子上的荧光标记的核苷酸， 从而使标记物发出荧光，相机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA 片段上的荧光碱基 之后，结合的核苷酸会被移除，然后，进入下一次结合。 优缺点：不需要PCＲ扩增，所以能反映样本的真实情况，通量也较高， 但由于该技术限制可读的DNA片段长度平均仅为32bp，而且其高度精密 的显微镜不仅造成其仪器庞大价格昂贵，而且对环境要求高升级困难。
第三代测序技术：快速，直接测序，简洁易用，具有强大的扩展性。
三代测序技术的比较
基因组测序的应用与实践
DNA水平的应用： 1、全基因组的测序 2、基因组重测序 3、宏基因组研究 RNA水平的应用： 1、转录组测序 2、小分子 RN A 测序
表观基因组学应用：1、转录因子结合位点测序 2、 DNA 甲基化测序序原理
3、荧光自动测序技术
荧光自动测序技术基于Sanger原理, 用荧光标记代替同 位素标记, 并用成像系统自动检测, 从而大大提高了 D NA 测序的速度和准确性。
4、杂交测序技术
不同于化学降解法和Sanger法, 而是利用 DN A 杂交原理, 将一系列已知 序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与 其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列信息。该方法检测速度快，但误 差较大，且不能重复测定。
2、Solexa测序法：
使用的方法是克隆单分子阵列技术，将待测序的单个基因组 D N A 片段固定在载玻片表面不同的位置上随后 ,对这些单个的 D N A 片段 同时进行复制 , 生成大量微小的 D N A 簇 (D N A cluster)。最后 , 在与 Sanger测序方法类似的步骤中 , 分别采用 4 种不同颜色荧光基团标记 的 4 种核苷酸单体 , 以及标准的微阵列光学检测系统 , 同时检测阵列 中那些被固定D N A 链上的引物延伸过程。
准确性好，易掌握，但操作麻烦
2、 双脱氧链终止法（Sanger法）
核酸模板在 DNA 聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP , 其中的一种 用放射性 P32标记 )存在条件下复制时, 在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱 氧核苷三磷酸 (ddNTP) , 因为双脱氧核苷没有3-OH, 所以只要双脱氧核苷掺入链的 末端, 该链就停止延长, 若链端掺入单脱氧核苷, 链就可以继续延长。如此每管反 应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应 终止后, 分4个泳道进行凝胶电泳, 分离长短不一的核酸片段, 长度相邻的片段相差 一个碱基。经过放射自显影后, 根据片段 3’ 端的双脱氧核 苷,便可依次阅读合成片 段的碱基排列顺序。
优点：纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，测序的准确度 可达 99.8%以上 ，对于长达1000bp的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子 而言，无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜 快速地进行DNA测序成为可能。
三代测速技术的比较
第一代测序技术： 凭借其长的序列片段和高的准确率, 适合对新物种进行基因组长距框架的 搭建以及后期GAP填补, 但是成本昂贵, 而且难以胜任微量 DNA 样品的测序工 作。 第二代测序技术： 454 适合对未知基因组从头测序, 搭建主体结构, 但在判断连续单碱基重 复区时准确度不高。Solexa具有通量高、片段短、价位低的特点,适合于小片段 如miRNA 的研究。 SOLID 具有双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通 量, 但无法在基因组拼接中的广泛应用。
参考文献： 岳桂东 高强 高通量测序技术在动植物研究领域中的应用 生命科学 2012年第42卷 陈 勇 柳亦松 曾建国 ，植物基因组测序的研究进展 生命科学研究 2014.2 杨晓玲 施苏华 唐恬新一代测序技术的发展及应用前景 生物技术通报 2010年第10期 周晓光 任鲁风 李运涛 张猛 俞育德, 于军 下一代测序技术: 技术回顾与展望 生命科学
基因组测序原理
基因组测序原理
第一代测序技术 第二代测序技术
第三代测序技术
第一代测序技术
1、化学降解法
在该方法中, 一个末端被放射性标记的 DN A 片段在 5 组互相独立的化 学应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成5 组放射性标记的分子, 每组混合物中均含有长短不一的 DN A 分子, 其长度 取决于该组反应所针对的碱基在原 D NA 片段上的位置。最后, 各组混合物 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离, 再通过放射自显影来检测末端标记的 分子。
4、 Ion Torrent测序技术
原理：利用每个碱基在聚合反应中都会产生一个质子，从而改变了测序 池体中的pH值，而pH值变化则通过设置于每个池体底部的由集成电路 构成专一的pH值传感器进行检测 。
优点：无以伦比的快速、简捷易用的技术、强大的扩展性
第三代测序技术（直接测序）
1、Helicos单分子测序技术：
第二代测序技术（合成测序）
第二代测序流程：
第二代测序技术原理
1、454测序技术：
使用的是焦磷酸测序技术。 首先将基因组分割为长度为300 到 500 个碱基对的片 段 , 然后将双链解开 , 弃去互补链当中的一条 , 将另一条链与连接在塑料小珠上的复合 物结合 , 并使得每个珠子只与一条链发生结合。随后PCR,对结合在小珠上的片段进行 复制, 直到各个片段的拷贝完全覆盖其所在的小珠为止。接下来将珠子分散在一个包 含大约160 万个小孔的平板 上 , 并加入一系列的测序试剂和核苷酸。每当一个核苷酸 被添加到正在延伸的 D N A 链当中时 ,该反应会释放一个焦磷酸 ( PP i ) 分子 ,随即在ATP 硫酸化酶的催化下与腺苷酰硫酸反应生成 AT P , 在位于小孔中的荧光素酶催化下该ATP 被用于促进D-虫萤光素发光 。用CCD将每个微球发出光及其强度进行同时成像 , 并将 所记录下的发光现象与当时加入的核苷酸相关联 , 可以得到同时发生的几十万个DNA 片段的延伸情况。
2010年第40卷
陆祖宏 吕华 肖鹏峰 ，白云飞快速低成本全基因组 D N A 测序技术 中国生物工程医学 学报 2008.4
2、Nanopores新型纳米孔测序技术：
原理：单链DNA分子在电场作用下，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，使 得单个碱基与纳米孔内的环糊精作用，检测碱基通过纳米孔时的电流变化来实现 测序。 由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此 基础上使用多种方法来进行高通量检测。