鸟枪法测序步骤
• 第一，建立高度隆片段 的碱基总数应达到基因组5倍以上。
• 第二，高效、大规模的末端测序。 • 第三，序列集合。 • 第四，填补缺口。
鸟枪法测序简要
鸟枪法测序技术
DNA target sample
带有同位素标记的引物或者ddNTP被掺入到反应 中，以便于观测
自动一个带有28个DNA样品的胶图: 绿带：碱基A，, 蓝带 C, 黄带G，红带 T.
• 越小的片段跑得越快
自动测序仪
测序的趋势
相对而言一般很少实验室会自己做测序，一则自身测序费用比较高，而且荧光试剂容 易粹灭，同时也比较消耗时间，另外可能出现一些其它问题引起结果不成功。所以大 部分的测序都是送到相关的测序中心或者公司完成: --下面这个序列就是一个自动测序仪记录的一段DNA片段
• 荧光标记
– 化学合成时带有荧光素标记的ddNTPs被掺入到反应中。 – 每一种ddNTP都带有自身特定的荧光波长以便于观测
测序结果分析
目前一般采用凝胶电泳法分析-能够比较好的将每 一条dNTP产生的DNA条带分离开。
DNA测序胶: 老方法
在反应中加入不同的ddNTP得到结果
利用电泳或者放射自显影的 方法来分析DNA序列
▪ BACs and PACs
– 大规模测序通用质粒 – 对插入片段大小比较合适，而且容易使用 – 与其它正常质粒一样能够扩增和分离
全基因组鸟枪法测序
• 但是片段比较大时，如在基因组测序时，仅仅由Sanger方 法并不合适，因此Shotgun测序，将基因大片段打碎后测 序。鸟枪法战略（Shotgun Strategy）又称随机测序战略， 是由美国塞莱拉遗传公司创始人克雷格•文特尔发明，主 要针对大片段的全长测序。因为整个基因组太长而每次只 能测得一个500的小片断(read)。
Part II. 大片段DNA测序与基因组测序的大发展
19
蜜蜂基因组是如何获得的？基因组的建立• 目前基将基因组片段打碎DNA克隆群体。
酵母人工染色体(YACs) 200-1000 kb Bacteriophage P1 90 kb
基因组测序
生物信息系列讲座之二
大纲
I. 核酸DNA的发现以及测序历史简介 II. 双脱氧化(Sanger dideoxy method)测序 III.大片段的DNA测序与基因组测序的大发展 VI.人类基因组 V. 1000美元个体化基因组测序计划(The “$1,000 dollar
genome)
B. Maxam-Gilbert化学剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tedious
Sanger 双脱氧测序原理
3’
Single stranded DNA 5’
5’
3’
a) 常规的PCR，粘附(Anneal)
Sanger 双脱氧测序原理
5’
b) 在延伸的时候将
DNA聚合酶与加入
正常的dNTP，同时
掺入少量的双脱氧
的ddNTP
3’
DNA聚合酶 延伸方向
Sanger 双脱氧测序原理
On WebCT -- “The $1000 genome” -- review of new sequencing techniques by George Church
Part I.核酸测序原理
核酸发现与测序简史
DNA测序的简史
MC chapter 12
DNA测序的方法
A. 双脱氧法 (Sanger dideoxy) (primer extension/chaintermination) method: 最流行也是最广为接受的方法。
▪ YACs (yeast artificial chromosomes) – 插入大小: 200–1,000 kb
大片段插入载体
▪ Lambda 噬菌体 以及 cosmids
– 插入稳定 – 但插入片段的容量可能不足以做大规模的
测序
▪ YACs
– 能够插入大片段 – 但不太稳定，比较难实际操作
BACs and PACs
C. 焦磷酸测序(Pyrosequencing): measuring chain extension by pyrophosphate monitoring。焦磷酸测序 技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳， DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便，可以快速、准 确地确定DNA序列。
3’
T TT
T
5’
5’
3’
ddA
以ddATP为例，可以 看到在反应中带有T的
ddA
模板被掺入的互补的
ddATP随机停止。因
ddA
为ddATP不能够再使
ddA 其主链延伸。
如何读取这些DNA片段？
• 同位素标记
– 同位素标记的引物 (如 32P) – 同位素标记的dNTPs (如35S 或者 32P)
Cosmids 40 kb
Bacteriophage l 9-23 kb
质粒(2-6 kb)
大片段载体
▪ Lambda phage – 插入大小: 20–30 kb
▪ Cosmids – 插入大小: 35–45 kb
▪ BACs and PACs (bacterial and P1 artificial chromosomes (Viral) respectively) – 插入大小: 100–300 kb
SHEAR
End Reads (Mates)
Primer
550bp
SEQUENCE
SIZE SELECT
e.g., 10Kbp ± 8% std.dev.
LIGATE & CLONE
Vector
重叠群Contigs
▪ 重叠群是指一组相互重叠的染色体DNA序列 ▪ 如何建立重叠群基因克隆？ ▪ For sequencing one wants to create “minimum tiling path”