实验一毒理学实验的基本操作一、实验目的1、了解动物实验是毒理学研究的重要手段之一2、掌握小鼠动物实验的基本操作技术二、实验器材与试剂电子称、小鼠固定器、注射器（3号针头）、灌胃针（12号针头）、棉签、镊子、眼科镊、毛细管、小号毛笔、品红、苦味酸、生理盐水、巴比妥钠、报纸、5ml离心管三、实验内容1. 实验动物的抓取和固定。

2. 实验动物的选择、性别鉴定、随机分组及标记。

3. 实验动物的给药途径（麻醉）：灌胃及腹腔、尾静脉、皮下注射。

4. 实验动物的采血：摘取眼球法。

5. 实验动物的处死：颈椎脱臼法。

实验动物的种类——小鼠（Mouse )（一）小鼠的捉拿、固定（二）辨别小鼠的性别，小鼠的编号及染色方法，完全随机分组1. 颜料涂擦被毛编号法（常用于大小鼠）：红色：0.5%中性红或品红溶液黄色：3-5%苦味酸溶液（水）80-90%苦味酸酒精饱和溶液2. 实验动物的分组——完全随机分组法将符合实验要求的40只小白鼠随机分配到A，B两组。

（1）动物编号1-40；（2）根据随机数字表，任意指定第10行第15列，从左到右依次读取40个两位的随机数字；（3）对随机数字按大小顺序排序，如数字相同，按先后顺序，先出现的为小；（4）随机数字序号为1~20号对应的小鼠分为A组，21~40号对应的小鼠分为B组。

（三）常用给药方法1、经消化道给药法A自动摄取法B灌胃给药法：小鼠专用灌胃针由注射器和喂管组成，喂管长约1nm，喂管尖端焊有一金属小圆球，金属球中空，用途是防止喂管插入时造成损伤。

金属球弯成20度角，以适应口腔与食道之间弯曲。

将喂管针头尖端防放进小鼠口咽部，顺咽后壁轻轻往下推，喂管会顺着食管滑入小鼠的胃，插入深度约3cm。

用中指与拇指捏住针筒，食指按着针竿的头慢慢往下压，即可将注射器忠的药液灌入小鼠的胃中。

在插入过程中如遇到阻力或可看见1/3的针管，说明灌胃并没有插入胃中，需要取出重新操作。

2、注射给药法A皮下注射B腹腔注射(巴比妥钠)：左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部，右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两恻进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3nm左右，接着使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失。

固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液和尿液后即可注射药液。

注射量为0.1-0.2ml/10g体重。

C尾静脉注射3、涂布给药法药物经皮肤吸收、局部作用或致敏作用时间根据药物性质和要求定（四）摘除眼球采血左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。

用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。

采血完毕立即用纱布压迫止血。

每次采血量0.6-0.1mL（五）实验动物的处死方法大白鼠、小白鼠：脊椎脱臼法断头法急性放血法空气栓塞法实验二小鼠骨髓细胞微核实验(一)目的通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE)微核测定方法。

(二)原理微核试验是用于染色体损伤和十扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。

微核是指存在干细胞中主核之外的一种颗粒.大小相当于细胞直径的1/20~1/5,呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。

一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。

所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。

微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。

由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中的微核。

(三)器材与试剂1.器材手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸,2m1注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。

2.试剂甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液(取Giemsa染料1g，甘油66m1，甲醇60m1。

先将染料置于研钵内，加人少量甘油混合研细，再分次倾人剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置60℃水浴2h，取出待冷却后加人甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。

该储备液存放的时间越长，染色效果越好。

临用时用pH6.B的磷酸盐缓冲液配制为10%的应用液)、pH6.8的磷酸盐缓冲液。

(1) 1/15mo1/L磷酸二氢钾溶液:称取分析纯KH2PO4 9.06g，用蒸馏水溶解并定容至100Oml。

(2) 1/15moI/L磷酸氢二钠溶液:称取分析纯Na2HPO4 9.45g用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

（3) pH6.8的磷酸盐缓冲液:取1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40 m1和1/15mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60m1，两者混合均匀即成。

3.阳性对照物环磷酞胺或丝裂霉素C。

(四）操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择:一般常用的试验动物为大、小鼠。

以小鼠使用最为广泛，要求体重18~~20g，7~12周龄。

每组小鼠数量10只，雌雄各半。

(}〕染毒途径:根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。

但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。

(3)染毒次数及取样时间:研究证实化学毒物需在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作用。

不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间也不尽相同。

波动范围可以达到24~72h。

这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。

考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒的方法。

其中以4次染毒比较方便合理。

即每天染毒一次，连续4天，第5天取样。

这样，取样一次就能覆盖24~72h高峰，如果高峰延迟到96h也不会漏掉。

(7)剂量选择:受试化学毒物的最大剂量除受溶解度大小所限外，应达到最大耐受量。

一般情况下，应设3~5个或更多剂量组，剂量覆盖的范围要达到3个数量级以上。

同时还应设立阳性对照组和阴性对照组。

阳性对照组可用环磷酞胺(50~100mg/kg)或丝裂霉素C(lOmg/kg)腹腔注射1次或2次。

阴性对照组使用等体积的溶剂。

2.骨髓液的制备和涂片试验动物最后一次染毒后.按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨，擦净血污、剔去肌肉，剪去骨垢，用小型弯止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片。

也可在动物处死后，迅速用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去两端的骨髓，用带针头的2m1注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔内，将骨髓冲人离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀，以1000r/min离心lOmin，弃去多余的上清液，留下约0.5m1与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的载玻片上，推片。

阳性及阴性对照组按上述方法同时进行处理。

3.固定将推好晾干的骨髓片放人染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干。

不能及时染色的涂片也应固定后保存。

4.染色将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa应用液(Giemsa储备液1份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9份)染色10~15min，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。

5.观察计数先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在油镜下观察计数。

PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈橘黄色。

细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。

一个细胞内可出现一个或多个微核。

计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。

(五)结果分析与评价本试验中只计数PCE中的微核，微核率以千分率表示。

每只动物为一观察单位。

每组的雌、雄动物分别计算微核PCE的均值。

雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算;正常的PCE/NCE比值约为1(正常范围为O.6~1.2)。

比值<0. 1，则表示PCE形成受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。

阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致。

微核试验所获数据资料的频数分布尚无定论，多种统计学方法(如泊松分布、二项分布、X2检验等)均有人用于试验结果的统计分析。

该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片及优质的染色。

实验三单细胞凝胶电泳实验一目的通过本次实验，学习和掌握单细胞凝胶电泳技术测定方法。

二原理DNA链多为磷酸复合物，在生理条件下DNA的多聚核酸链多呈阴离子状态，当外源性因素（如紫外照射）造成DNA链断裂时，负超螺旋结构变得松散，那么在电场作用下DNA就会以一定速率向正极移动。

在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等结构受到破坏，胞内蛋白质、RNA及其它成分均扩散到溶液中，而核DNA由于分子量大而只能留在原位。

经碱处理和在碱性电解质的作用后，DNA解旋，损伤的DNA断链及其片段会被释放出来，而在电泳条件下，DNA片段可进入凝胶孔隙发生迁移。

由于这些DNA分子量很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向正极移动，形成彗星状的图像。

在一定条件下，DNA迁移距离和DNA含量分布与DNA 损伤程度呈线性相关。

随着DNA损伤程度加剧，断片数目增加，表现为尾部DNA含量增加，彗尾延长，荧光强度加强。

三试剂1.PBS：Na2HPO4·12H2O58g，KH2PO44.8g，NaCl 160g，KCl 4g，配为PH7.4的10×PBS。

2.细胞裂解液：NaCl 146.1g，EDTA37.2g，Tris1.2g，用NaOH调PH至10，定容到800ml，室温保存。

3.细胞裂解液最终应用液：加入新鲜5%Triton×100和10%DMSO，用ddH2O定容到1000ml，充分混匀，使用前4℃冷却1h。

4.电泳液：10mol/LNaOH（200g/500mlddH2O），200mmol/LEDTA-Na2（14.89g/200mlddH2O PH10）两者分别室温保存。

使用时，将30ml 10mol/LNaOH和5ml 200mmol/LEDTA-Na2混合并定容到1000ml。

总制备量取决于电泳槽大小，大槽效果较好。

5.中和液（0.4mol/LTris-HCl缓冲液：）：Tris48.5g溶于800mlddH2O中，用HCl调PH至7.5，定容至1000ml，室温保存。

稀释20倍则得到低渗液，注意PH调为7.4。

6.低熔点琼脂糖（LMPA）和正常熔点琼脂糖（NMPA）均用PBS配制。