9. 39
1. 38
8. 98
1. 1பைடு நூலகம் 16. 74
2. 19
100
2. 04
300
0. 41
注 :CFU , ×104/ g
0. 29 0. 06
2. 04 0. 82
0. 31 0. 12
2. 45 2. 04
0. 36 0. 30
3. 27 1. 23
0. 43 0. 16
4. 08 2. 04
含药平板 :在牛肉膏蛋白胨培养基中加入恩诺 沙星 ,使平板中药物含量分别为 0 、0. 1 、0. 3 、0. 5 、1 、 3 、5 、10 、30 、50 、100 、300μg/ mL 。 1. 4 土壤处理 土壤采集后 ,过 4 mm 筛 ,分装到 250 mL 三角瓶中 ,150 g 土/ 瓶 。加入恩诺沙星使 药物浓度分别为 :0 、1 、2 、4 、8 、20 μg/ g ,每个处理设 3 个重复 。将三角瓶放在培养箱中 28 ℃培养 2 d 后 ,分别在各三角瓶中采集土壤进行稀释 ,制备细菌
0. 53 0. 27
20
细菌数 耐药率
CFU
%
745. 21 100. 00
665. 18 89. 26
477. 34 64. 05
396. 08 53. 15
327. 89 44. 00
249. 90 33. 53
221. 73 29. 75
155. 17 20. 82
70. 23 9. 42
15. 93 2. 14
比 ,即为土壤细菌在不同药物含量水平上的耐药菌 发生率 。由表 1 可见 ,随着培养基药物含量的增加 , 耐药菌发生率逐渐减少 ,但二者并不呈现明显的线 性关系 ,以空白对照组数据进行曲线估计的结果表 明 ,二者之间更符合指数方程关系 ,关系式为 :lny = 2. 7013 - 0. 0308x (r = 0. 9244) ,其中 y 是耐药菌发 生率 ,x 为平板的药物浓度 ,此关系式适合于平板药 物含量大于 1μg/ mL 的情况 。
恩诺沙星诱导土壤细菌产生耐药性的最低选择 浓度 ( MSC) 的确定 :在以上试验中 ,能够引起细菌 的耐药菌发生率产生显著变化的最小药物浓度 ,被 认为是诱导土壤细菌产生耐药性的恩诺沙星的最低 选择浓度 。
2 结果与分析 各组土壤样品在含药平板上生长的菌落数的变
化情况如图 1 所示 ,在某个浓度的药物平板上生长 的细菌 ,即对该药物浓度耐受的细菌 。各组土壤样 品在药物含量不同的平板上分离培养的细菌数 ,与 该组样品在不加药平板上分离培养的细菌数的百分
悬液 。稀释方法为 :取土壤 10 g 于 250 mL 三角瓶 中 ,加入 90 mL 灭菌水 ,震荡 30 min 后取 10 mL 混 悬液于另一个 250 mL 三角瓶中 ,加入 90 mL 灭菌 水 ,按此方法依次稀释至合适浓度 。 1. 2. 3 细菌培养 将上述不同浓度的细菌悬液各 取 0. 1 mL ,加入含恩诺沙星的牛肉膏蛋白胨固体培 养基上 ,涂匀 ,28 ℃培养 3 d ,计算各平板的细菌数 (CFU) ,以上试验重复进行 3 次 ,取 3 次试验的平均 值 。土壤样品稀释倍数以每个平板上菌落数 30～ 200 个为宜 。
0. 5
246. 63 34. 95 246. 63 37. 06 294. 82 43. 36 338. 10 44. 30 380. 57 49. 84
1
206. 62 29. 28 186. 61 28. 04 240. 92 35. 44 259. 70 34. 03 297. 27 38. 93
[ 1 ] 陈杖榴 , 吴聪明 , 蒋红霞 ,等. 兽用抗菌药物耐药性研究概况 [J ] . 四川生理科学杂志 , 2005 , 27 (4) : 1772180.
[ 2 ] Van den Bogaard A E , Stobberingh E E. Epidemiology of re2
sistance to antibiotics links bet ween animals and humans [ J ] .
中图分类号 : S851. 66 文献标识码 :B 文章编号 :052926005 (2008) 0420067202
近些年来 ,由于抗菌药物的广泛使用 ,尤其不合 理应用和滥用 ,导致细菌耐药率逐渐上升 ,多重耐药 现象日益严重[1] 。耐药性的普遍存在不仅严重影响 兽医临床的治疗效果 ,而且耐药性可能从动物通过 食物链 、环境或者动物和人的直接接触进行传递 ,从 而给人类医疗也带来压力[3] 。在自然界中 ,细菌的 耐药性是广泛存在的 ,某些环境微生物可合成抗生 素 ,从而在自然选择的压力下诱导了细菌耐药性的 产生 。但是 ,随着现代医学中抗菌药的大量使用 ,药 物随人和动物的粪便和尿液等排泄物进入环境 ,在 这种新的选择压力下 ,环境细菌的耐药性越来越普 遍 ,再加上耐药基因的传代 、转移 、扩散 ,耐药菌越来 越多 ,耐药程度不断增加 ,形成高度和多重耐药[527] 。 本试验通过在土壤中加入不同浓度的恩诺沙星后 , 采用琼脂稀释法测定土壤细菌在恩诺沙星含量不同 的平板上的生长情况 ,初步确定能诱导土壤细菌产 生耐药性的恩诺沙星的最低残留浓度 。 1 材料与方法 1. 1 土壤 采自华南农业大学花园苗圃 10～20 cm 土层的均质土壤 ,色深 ,质细 。 1. 2 药品 恩诺沙星 :含量 98. 5 % ,批号 0508212 2 ,浙江国邦兽药有限公司 。 1. 3 培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基 :牛肉膏 5. 0 g 、蛋白胨 10. 0 g 、氯化钠 5. 0 g 、琼脂粉 18 g ,加 蒸馏水 1 L ,调 p H 7. 2～7. 4 ,高压灭菌 。
2. 86 0. 38
2. 86 0. 38
3 讨论 由于有些药物在土壤中不易降解 ,一次使用药
物就能使土壤中较长时间维持一定水平的药物浓
度 ,土壤细菌在药物的选择压力下产生耐药性 。本 试验中单剂量给予不同浓度的恩诺沙星就能对土壤
中耐药细菌产生明显的选择作用 ,初步确定土壤中 恩诺沙星含量为 4 μg/ g 是对细菌选择产生耐药性 的最低浓度 , 即土壤中恩诺沙星含量大于或等于 4μg/ g时 ,土壤细菌中耐药菌显著增加 ,本试验没有 进行多次用药的研究 ,但多次用药对土壤细菌的危 害性可能会更大 。细菌的耐药性可能从动物通过食
显著 ,则说明是在药物的选择压力下诱导产生了耐 药菌 。由此可见 ,土壤中恩诺沙星含量大于或等于 4μg/ g时 能诱 导产 生耐 药 菌 , 认 为 4μg/ g 是 恩 诺
沙星对土壤细菌选择产生耐药性的浓度 ,即 4 μg/ g 为恩诺沙星能够诱导出土壤细菌耐药性产生的最低 残留浓度 。
图 1 含药培养基上生长的菌落数的变化情况
表 1 用不同浓度恩诺沙星( 1～20 μg/ g) 处理后土壤细菌在含药培养基上的生长情况
平板药物 浓度
(μg/ mL)
0
细菌数 耐药率
CFU
%
1
细菌数 耐药率
CFU
%
土壤中恩诺沙星含量 (μg/ g)
2
4
细菌数 耐药率 细菌数 耐药率
CFU
%
CFU
%
8
细菌数 耐药率
CFU
%
0
705. 60 100. 00 665. 58 100. 00 679. 88 100. 00 763. 18 100. 00 763. 58 100. 00
0. 1
515. 73 73. 09 505. 11 75. 89 540. 23 79. 46 630. 88 82. 66 628. 43 82. 30
0. 3
293. 18 41. 55 295. 63 44. 42 347. 90 51. 17 401. 80 52. 65 461. 42 60. 43
68
中国兽医杂志 2008 年 (第 44 卷) 第 4 期 Chinese Journal of Veterinary Medicine
各添加药物组的耐药菌发生率的变化情况 ,分 别与空白对照组的耐药菌发生率的变化情况进行 T 检验 ,结果表明 ,1μg/ g 组 P = 0. 674 ,2μg/ g 组 P = 0. 265 ,4 μg/ g 组 P = 0. 008 ,8 μg/ g 组 P < 0. 001 , 20μg/ g 组 P < 0. 001 ,即除了 1 μg/ g 和 2 μg/ g 组 外 ,其余各组细菌的耐药菌发生率与空白对照组之 间差异显著 ( P < 0. 05) 。空白对照组不同浓度的药 物平板上生长的土壤细菌 ,说明该细菌对这种浓度 的恩诺沙星本来就有耐药性 ,是自然条件下该土壤 细菌对药物固有的抗性 ;加药组不同浓度的药物平 板上生长的耐药菌与空白对照组生长的耐药菌差异
收稿日期 :2007208228 基金项目 :国家自然科学基金重点资助项目“兽药及添加剂残留 毒性与生态毒理研究”(30130140) 内容之一 作者简介 :马驿 (19762) ,男 ,讲师 ,博士 ,主要从事兽医药理与毒 理学研究 , E2mail : mayi761 @163. com 通讯作者 :陈杖榴 , E2mail : chenzl @scau. edu. cn
菌数/ g 干土 = 计数皿平均菌落数 ×10 ×计数 皿稀释倍数 ×(鲜土重/ 干土重) 1. 5 数据处理 各组样品的细菌悬液在药物含量 不同的平板上培养的细菌数 ,与该组细菌悬液在不 加药平板上分离培养的细菌数的百分比 ,即为该组 土壤细菌在药物含量不同平板上的耐药菌发生率 。
将各添加药物组的土壤细菌在药物含量不同的平板 上耐药菌发生率的变化情况 ,分别与空白对照组的 耐药菌发生率的变化情况进行 T 检验 ,比较两者的 差异性 。