2、装柱 将平衡好的Sephadex G-75凝胶浆的稀稠度调节到有
利于灌装，然后抽真空排除凝胶浆中溶解的空气。将柱子固 定在坚固不动的支架上，并用铅垂线使其垂直。向柱子中充 满缓冲液，检查其是否漏水，柱出液口应打开以排除里面的 气泡，然后将柱出口关闭，使柱中洗脱剂的体积约占柱总体 积的15%。将平衡好的凝胶浆徐徐灌入柱内，灌时避免产生 气泡。
5、洗脱与收集 柱的洗脱借助恒流泵进行，洗脱速度为0.5ml/min，
用部分自动收集器收集，每5min转换一个试管，用波长为 280nm的紫外检测仪进行检测 。检测结果用台式记录仪记 录，走纸速度为6cm/hr。将洗脱峰分别合并，然后测定酯 酶活力和蛋白质浓度。
6、柱的再生与保存 蛋白峰出现后，再用大量洗脱剂洗凝胶柱。用钠氏试
在限定的的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值 却是随着分离物相对分子质量的变化而变化的。分离物相 对分子质量大，值小；反之，则值增大。
三、试剂与器材
待分离蛋白质样品：须经过透析出去硫酸氨并进行适 当的浓缩。
0.1M磷酸氢钠缓冲液（PH7.0） Sephadex G-75；高速离心机，型号为TGL-6B；低 速离心机，型号为800型；核酸蛋白检测仪，型号为HD88-5AⅢ；蛋白自动部分收集器，型号为BSZ-100；台式记 录仪。
四、实验方法
1、凝胶与柱的选择 根据待分离蛋白质的分子量选择相应规格的凝胶，例
如分子量为67KD可选择Sphadex G-75凝胶。层析柱长100cm ，直径2 cm。
2、洗脱剂与凝胶的准备 凝胶色谱层析材料不受大多数缓冲液的影响，因此凡
是对分离样品稳定的缓冲液都可以作为洗脱剂。称取2０g Sephadex G-75凝胶颗粒，放入过量的蒸馏水中，浸泡１ ０小时，使之充分膨胀，然后将极细小颗粒倾泻除去（重 复此操作数次），然后用缓冲液充分平衡否 则容易造成漏气、漏液。
4、装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求 的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。 但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床 高度下降。
5、始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发 ，凝胶变干。
4、样品准备与加样 将浓缩好的蛋白质样品2ml进行加样。加样操作十分关
键，因为样品的不必要稀释或样品进入凝胶床不均一都能导 致区带过宽，从而影响分辨力。在洗脱剂刚刚排干（刚看不 见洗脱剂的液面）时，轻轻的将样品加在凝胶表面，注意不 要碰坏凝胶表面。加样后打开柱出水口使样品完全渗入凝胶 床，再如上方法加上2次小体积的洗脱剂。上述过程作好后 立即在凝胶床上加入几厘米高的洗脱剂，然后与恒流泵及洗 脱液贮槽相联接，进行洗脱
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、 筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完 全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些 小分子化合物则不能排阻，可让其在筛孔中自由扩散、 渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度 可用分配系数KAV（被分分配系数离化合物在内水和外水 体积中的比例关系）表示。值的大小与凝胶床的总体积 （Vt）有关、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积 （Ve）有关，即：
剂检测NH4+的存在。直至流出液中不再有NH4+为止。短时 间保存，可将凝胶柱放在4℃冰箱中。
五、注意事项
1、根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容 积，计算所需凝胶干粉的重量，用洗 脱缓冲液使其充分溶胀。
2、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要 选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多， 最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径 太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组分移 动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但 柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好 。
柱装好后停10min，然后将出口打开，使过量的洗脱剂 排出。当洗脱剂在胶面上2—5cm时，将出口关闭。如需继 续装柱，应将凝胶表面均匀搅拌，然后继续装柱。将恒压 洗脱剂贮瓶与柱入口相联，开始时流速不断下降，逐渐稳 定下来。
检查装柱是否均匀，如柱中出现气泡等暇疵，要重新 装柱。剪一圆形滤纸片放在凝胶表面。
分子筛柱层析实验
一、实验目的：
1、了解凝胶柱层析的原理及应用。 2、掌握凝胶柱层析的基本操作技术。
二、实验原理
凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按相对分子质量大小 分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒 的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒 中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较 快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒 中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡。因此，就 要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分 离。