磷酸化肽段的分离和富集
使用磷酸化蛋白的抗体 IMAC法 磷酸基团亲和取代
磷酸化蛋白的抗体
目前已经开发出针对 特异磷酸化位点的单 克隆抗体，-pTyr， -pSer， -pThr
利用这些单克隆抗体 进行亲和纯化，可以 分离和富集特定磷酸 化的蛋白
固定金属鳌和亲和层析(Immobilized
优点
灵敏 直观
局限
同位素污染，操作不方便 若磷酸化转换速率低，则难以检测 不能区分不同残基的磷酸化
抗体免疫印迹法
蛋白样品的制备 双向电泳 检测
考染或者银染 免疫印迹（磷酸化特异抗体）
差异点分析 检测
抗体免疫印迹法
优点
灵敏 直观
克服同位素法的局限
无同位素污染，操作相对方便 可检测无磷酸化转换的蛋白 能区分不同残基的磷酸化
凝集素在糖蛋白研究中的作用
凝集素是一类能和糖结合的蛋白，专一 识别某一特定结构的单糖或寡糖中特定 的糖基序列并结合
由于其专一性，不仅可以用于分离纯化， 还可以用于结构分析
伴刀豆球蛋白（ConA）－N-高甘露糖 麦胚凝集素（WGA）－杂合型N-糖链 兵豆凝集素－核心岩藻糖
息）； 研究糖基化的功能（即功能信息）
蛋白质组学分析糖蛋白
糖含量 糖苷键类型 糖基化位点
糖含量的测定
比较糖苷内切酶作用前后糖蛋白的分子量
糖苷键酶F作用前
糖苷键酶F作用后
糖苷键酶F：切断N-连接 五糖核心最内侧的 GlcNAc-GlcNAc，剩一个 GlcNAc
核糖核酸酶B中糖基含量测定
糖基化类型及其位点的分析
糖苷内切酶和蛋白酶结合的方法
先用糖苷内切酶消化，再用蛋白酶消化，通 过分析糖苷酶作用前后MS发生位移的肽段， 即可确定含糖基化的肽段
结合串联质谱，可进一步分析糖基化肽段的 氨基酸序列，从而发现糖基化位点
核糖核酸酶B中糖基化位点的分析
糖苷键酶F作用前
糖苷键酶F作用后 剩一个GlcNAc
糖苷键类型
N连接：天冬酰胺序列子Asn-X-Thr/Ser O连接:Ser/Thr 糖基磷脂酰肌醇锚 (glycosyl phophotidylinositol, GPI)：通常
是一些细胞膜蛋白或细胞壁蛋白，通过肌醇和细胞膜磷脂层 结合
蛋白质糖基化研究的基本目标
寻找编码糖蛋白的基因（即基因组信息）； 寻找糖基化位点（即糖基化位点信息）； 解析糖链及糖基化肽段的结构（即结构信
以-干酪素做测试
பைடு நூலகம்
磷酸肽的识别
MALDI－TOF－MS结合磷酸酶水解法 磷酸酯酶处理蛋白质的前后，磷酸化肽段的质量数会有变化，比较 前后图谱，寻找质量数变化80或98Da和强度增大的信号就很可能是 磷酸化肽段。 丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段的质量变化可能是80Da，也可能是98Da； 酪氨酸磷酸化肽段只有80Da的质量数变化
样会与肽段中的天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基结合
对磷酸化肽段中的酸性残基进行了预先的甲基酯化，封闭了上述 氨基酸的酸性侧链。
IMAC
填料－交联剂－金属螯合剂－金属离子
MS MS/MS
磷酸基团亲和取代
将磷酸肽上的磷酸基团用另一种配基取代， 再用亲和纯化的方法分离富集磷酸肽
生物素取代
生物素取代
序列和磷酸化位点。 磷酸化位点产生丢失80kD或者98kD的子离子。
糖基化的蛋白质组学研究
糖基化蛋白的生物学意义
在真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化 蛋白质糖基化在蛋白质折叠、蛋白质定位和转运、
蛋白质溶解性、抗原性以及细胞与细胞的相互作用 等方面都有着重要的作用 细胞膜的许多蛋白质是以糖蛋白形式存在 糖低聚物在细胞间信号传递中也起了重要的作用 成为免疫系统调控和癌症治疗的最重要的线索之一 糖链比核酸和蛋白质在结构上更具有可变性，复杂 性
氨基酸序列的测定
m/z=4792.23
TSAASSSNYCNQM
RQHMDSSTSAASSSNYCNQ MMKSRNLTKDRCKPVNTF VHE
糖基化类型的分析
糖蛋白进行蛋白酶切，得到含糖肽段，对肽段直接 进行ESI-MS/MS，以及MALDI-TOF-MS的PSD， 可以直接得到单糖碎片，从而确定糖链结构。
4蛋白组学翻译后修饰
第五章 蛋白质 翻译后修饰的鉴定
磷酸化蛋白质的检测
32P放射性同位素法 抗体免疫印迹法
32P放射性同位素法
-32P-ATP渗入培养 蛋白样品的制备 双向电泳 检测
考染或者银染 放射自显影
差异点分析 检测
autoradiography
放射性同位素法
PSD－MALDI－TOF－MS
PSD：源后衰变（post-source decay），母离子在飞行中发生断裂，丢 失一个中性分子。磷酸化肽段丢失HPO3或者H3PO4，产生质量数减少 80kD或者98kD的子离子。
磷酸化位点的确定
用串联质谱（MS/MS）对磷酸化肽进行分析。 将磷酸化肽打碎，产生全部碎片离子，根据离子数量推断肽
metal affinity chromatography ，IMAC)
IMAC技术是用于富集磷酸化的肽段，对磷酸化蛋白质的 富集是无效的。
利用了磷酸基团的负电性，与IMAC柱上的带正电的金属 离子结合，从而起到纯化的作用。
IMAC技术对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化都有效 IMAC技术使用的金属离子主要是Fe3+、Ga3+ 、Cu2+等 最主要的缺点是特异性不强：IMAC柱上的正电荷位点同