如果蛋白是已知的，可通过质量数来确定肽段
在某些情况下，肽段只含有一个丝氨酸、苏氨
酸或酪氨酸残基，则很容易找到磷酸化位点，
一、生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能

蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团
从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生
物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的
传递过程中占有极其重要的地位

蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移 到底物蛋白质氨基酸残基上的过程

蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用

质谱技术 质谱技术结合磷酸酶水解

MALDI-TOF MS 可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸 酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点 原理：


磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团 而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF
MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸
化位点
原理
消除反应是从反应物的相邻碳原子上 消除两个原子或基团，形成一个π键 的过程 1,2 – 消除反应（β-消除反应）

局限性

丢失低丰度、没有结合到IMAC柱上的磷酸化肽段 具有多磷酸化位点的肽由于较强的亲和力较难被 洗脱下来


酸性基团（天冬氨酸、谷氨酸）、电子供体（组 氨酸）也会结合到柱上，造成非磷酸化肽的污染

效果：依赖于所选择的金属离子、填充柱的材料 及洗脱程序


金属氧化物/氢氧化物亲和色谱 Metal oxide/hydroxide affinity chromatography, MOAC TiO2、Al(OH)3、ZrO2 TiO2富集磷酸肽原理： TiO2是一种两性物质，由于钛原子和氧原子的原 子表面化合价不饱和，TiO2在不同的pH值下可以 表现为路易斯酸或路易斯碱 在酸性溶液中，钛原子带正电表现为路易斯酸， 可以与阴离子结合。磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐都 与TiO2具有高度的亲和力，其中TiO2与磷酸盐的结 合能力最高 调节pH值后，TiO2可用于富集磷酸肽
二、磷酸化蛋白质分析的概述

磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式
的质谱分析中信号受到抑制，在MALDI源的质 谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化 肽段的信号强度要低很多 磷酰键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷

酸化蛋白鉴定要困难的多
三、磷酸化蛋白质的检测

32P放射性标记法
抗体免疫印迹检测法

质其磷酸化的部分仅占其总量的10%

磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段 很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中
二、磷酸化蛋白质分析的概述
体外 pmol
32p蛋白标记
体内 fmol
32p细胞标记
蛋白质分离
磷酸氨基酸 分析 蛋白酶切 相关分析 2DPP作图 μHPLC μLC－ESI-MS或 MALDI-MS μLC－ESI-MS 2DPP作图 蛋白酶切

在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点

胞内信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）

蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的
酶“活性”

对外界信号具有级联放大作用

蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信
号的持续反应

磷酸化类型

丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化

精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸
IMAC
二、磷酸化蛋白质分析的概述

双相磷酸多肽薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一 块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相，分离得到的 磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测 此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷 酸化状态的重要信息


(1)磷酸化位点的最大数目 (2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸 化的相对化学计量 (3)电泳和TCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性 的相对状态
和谷氨酸的酰化

丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化 =1800：200：1

被磷酸化修饰的蛋白

改变所带的电荷


改变催化基团的性质
改变蛋白质的构象
改变蛋白质的亚细胞分步
蛋白质功能变化的多样性

蛋白质磷酸化研究有三个主要目的

(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白
质在体内的磷酸化氨基酸残基定位
1、32P放射性标记法

32

P 放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测 方法 放射性32P标记的ATP处理细胞，使32P掺入磷酸化 蛋白质

培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的 细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，用不含磷酸盐的 标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入32P标 记磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激 酶利用被放射标记的ATP使底物磷酸化

离子交换和等电聚焦 离子交换（strong aion exchange,SAX/ strong caion exchange,SCX ）:离子强度 不同进行分离

IEF:等电点不同进行分离
主要用于复杂样本的预分离，降低样本复杂 程度
结合金属亲和等其他富集技术，可取得很好 的效果

2、磷酸肽的识别

(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶 (3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响

二、磷酸化蛋白质分析的概述

磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋 白质组学研究的关键技术之一
细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的 表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部 分的分析也很困难, 一般一个发生磷酸化的蛋白

直接检测在碰撞诱导解离过程中丢失的碎片
离子
前体离子扫描

分析磷酸肽

负离子模式
设定Q3中仅能通过的子离子质荷比m/z 79， 即磷酸肽丢失的PO3-，这样得到的质谱图仅 显示丢失m/z 79的离子的谱峰 丢失磷酸根离子的磷酸肽谱峰 多肽产生的各种碎片离子中，质量数在 79Da附近的几乎没有

免疫沉淀物

固相金属亲和色谱 Immobilized metal affinity chromatography, IMAC IMAC柱：金属离子、螯合剂、填料

原理：带正电的金属离子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+ 可以与带负电的磷酸集团产生静电交互作用而 结合，这种结合能力受pH值、离子强度和溶液 有机相的影响，在高pH或磷酸盐存在的缓冲液 中，金属离子与磷酸基团间的结合被破环，磷 酸肽被释放出来



图 利用MALDI-TOF/TOF谱图鉴定磷酸化肽段 a: 酶切产物的一级质谱图。磷酸化肽段的质谱峰用星 号标出, 其相对未磷酸化肽段的理论分子量位移80 Da (HPO3 = 80 Da); b: a中标记星号的质谱峰的二级质 谱分析。在图中可见比母离子小98 Da (H3PO4 = 98 Da)的中性缺失峰


3、磷酸化氨基酸位点的确定

用于确定磷酸化肽中磷酸化位点的质谱方法基 于两种不同原理


第一种方法取决于磷酸酯键的化学稳定性
如在ESI质谱仪的碰撞室或离子源中，或在
MALDI—MS的源后裂解（PSD）过程中磷酸化肽
可通过磷酸酯键断裂产生的碎片离子鉴定

第二种方法基于肽段增加的磷酸酯基团的质量 数

串联质谱(MS/MS)
前体离子扫描

通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷 酸肽的存在；磷酸化肽经CID（碰撞诱导解 离）后会产生磷酸基团的特异性片段，这些 特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫 描时可作为磷酸肽的“报告离子”
前体离子扫描

在三级四级串联质谱采用

使各种质荷比的离子依次通过Q1分析器，Q2 为碰撞诱导解离室，将Q3分析器的电压和频 率设定为只能传输某一特定质荷比，即特定 质荷比的子离子
中性丢失扫描

分析磷酸肽

从带一个正电荷的[M+H]+肽混合物中寻找丢失中性 磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则Q1和Q3的扫描电压差 所代表的质荷比应为m/z 98 从带两个正电荷的[M+2H]2+肽混合物中寻找丢失中 性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则Q1和Q3的扫描电压 差所代表的质荷比应为m/z 49 只能分析磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸

局限性

磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质
不能标记组织样本
放射性污染
2、抗体免疫印迹检测法




通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反 应(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用 的方法 在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化 已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗 体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝 氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有 空间障碍,所以抗体的结合力较差 免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集 目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋 白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪 氨酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验
PSD-MALDI-MS分析

源后衰变

发生在源内离子化之后的分子裂解 MALDI-TOF-MS离子源内发生的离子在真 空无电场飞行管飞行过程中发生结构裂解， 丢失一个中性分子后产生了碎片离子

碎片离子具有与其前体离子相同的飞行速度，但 由于质量小，动能比前体离子小（亚稳离子） β－消除反应丢失HPO3或H3PO4，产生数减少 80Da或98Da亚稳离子