系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确 的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内霉素
阅读框架 繁殖迅速、培养简单、操作方便、 遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物
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工程菌高密度发酵工艺

自重组DNA技术产生以来，许多在临床上具有重要治疗价值的蛋白药物通过携带有目的基因的大肠杆菌成功地在实验 室和工厂得以生产。利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺，生物工程菌发酵的目的 是希望能狄得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主、载 体和目的基因二者之间的相互关系，而且与其所处环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远 不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出适合外源基因表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度 培养是近几年发酵工业的目标和方向。对于大肠杆菌，尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲，实现高密度发酵，可相应的 缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。通过对基因工程菌 (RRhPI-pQE40 E.coli M15)发酵条件的优化，可以看出摇床转速与补料方式对发酵结果影响最大.摇床转速与发酵过程 中氧气的供给有很大的关系。大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长及重组产物的影响很大， 溶解氧的浓度过高或过低都会影响大肠杆菌的代谢，使后期生长变得极为缓慢，而且会降低重组蛋白的表达量.菌体在 进行大量的增殖过程中，消耗氧进行氧化分解代谢，因而饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵的进行菌体的细胞密 度迅速增加，溶解氧的浓度因不断被菌体消耗而降低，细胞的生长开始减慢，ST值下降，尤其在发酵后期，下降幅度 更大。在高密度发酵后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结果 导致外源蛋白的表达量很低。所以维持较高水平的溶氧浓度能提高带有重组质粒的大肠杆菌的生长繁殖，有利于外源 基因的重组蛋白的表达。一般的高密度发酵的通风速度达到18L/min ( 20L发酵罐)，搅拌速度达到500rpm以上，往往还 需要供给纯氧，需保持60%以上的溶氧饱和度，这样才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物的形成。 需要注意的是，要考虑通风速度和搅拌速度的增加对泡沫的产生和发酵液粘稠度的影响，需要在培养基中加入适宜的 消泡剂。
基因工程菌
大肠杆菌
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被选为基因工程菌的原因
常见易得，易于培养
质粒为常用运载体 代谢迅速,
基因工程菌的通性
经济高效
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作为表达外源基因受体菌的优劣比较
劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工
优势
基因克隆表达系统完善 全基因组测序，共有4405个开放型

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目的基因的构建
1. 2. 3.
利用病原真菌的毒力基因，例：真菌孢子附着基因，穿透体壁基 因等 利用外源毒力基因，例：蝎毒素基因、苏云金芽胞杆菌毒素基因 等 利用人工设计并合成基因
技术瓶颈
如何加快鉴定杀虫真菌毒力基因, 获得安全、高效的目的基
因 缺乏多基因多毒素表达系统 如何建立安全的转化子筛选系统, 克服工程菌株的潜在安全 性风险 如何克服真菌类生物农药杀虫慢、成本高的缺陷
2016/11/1
酵母表面展示与酶技术

酶的固定化是指借助物理或者化学方法将酶固定于特殊的相， 使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物和效应物分子 交换并发挥其催化效能的一种技术。与游离酶相比，固定化酶 提高了酶的稳定性，并使酶能够反复回收利用。但是，传统的 固定化方法也会产生一些不利因素，例如由于增加固定化操作， 导致酶固定化过程中的活性收率损失；另外由于固定化操作需 用载体，因而增加了载体成本费和固定化操作费用。
2016/11/1
表面展示与酒精发酵

传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原料。随着燃料酒精 需求的日益增长，以天然纤维素类资源生产酒精的研究也日益 受到人们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种潜在的可再 生资源，对解决未来能源问题有着巨大的潜力，因此，天然纤 维素酒精发酵具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维素水 解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构建了能够增效和按顺序 降解纤维素的全细胞生物催化剂。
2016/11/1
酵母表面展示系统与新药筛选

将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关蛋的 基因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质，有助于对未知基因 功能的研究，并能发现一些药物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新 药先导化合物。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵母双杂交技术相结 合，将抗体的scFv 片断连接到转录因子VP16 的激活结构域( AD) 上， 将抗原连接到LexA的结合结构域( DB) 上，以His3和LacZ 为报告基因， 建立抗原抗体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相互作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达，可通过营养缺陷培养基进行检测。 这种方法从scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异的抗体，为疫 苗及抗体类药物的研制提供良好的平台。
2016/11/1
酵母表面展示与酶技术

利用表面展示技术将具有催化活性的酶展示于酵母等微生物细 胞表面就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶 不同，表面展示的酶以共价或非共价方式固定于细胞外表面， 这种独特的空间定位使其相对自由酶而言有许多优良的特性， 如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复使用等，这些特点与传 统的固定化酶技术相似，但无需额外的蛋白纯化和固定的操作， 有着良好的应用前景。Katsumi利用α凝集素系统将来源于产黄 菌属的 OPH 展示于酵母细胞表面，细胞荧光强度测量表明每 个细胞表面可以展示 1.4×10 4 个 OPH 分子，酵母展示系统 OPH酶活性较大肠杆菌冰晶核蛋白展示的酶活性更高，为有机 磷化合物的脱毒提供了一种有效的生物催化剂。
2016/11/1
酵母细胞表面展示与生物吸附
环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附为基础的，例 如微生物对重金属的吸附就包括两种途径: ( 1) 与细胞表面复 合物结合，( 2) 逐渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消 化降解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨越细胞膜 这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可重复利用 利用表面展示技术能较好地解决这一问题，吸附蛋白直接展示 在细胞表面，不仅使吸附过程快捷高效还可以利用回复剂如 EDTA 对其进行处理使之不断重复利用。
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2016/11/1
酵母表面展示系统
2016/11/1
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酵母表面展示系统的类型

目前，最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达和絮凝素 展示表达。凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编码凝集素C端编 码序列(含GPI锚定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合 蛋白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌， 由于融合蛋白C 末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞 壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面。絮凝素展示表达系统 利用絮凝素基因与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表面， 此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。GPI锚 定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系 统与凝集素展示相似; 絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能 结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露 聚糖链并非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物。

2016/11/1
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天然苏云金芽孢杆菌作为杀虫菌的缺陷
苏云金芽孢杆菌存在的杀虫谱窄、持效期短等缺陷。严重影响 了苏云金芽孢杆菌的实际应用。但与转基因植物相比，基因重 组微生物具有研究快速、生产方便、应用灵活、害虫不易产生 抗性等诸多优点。 从自然界筛选新的苏云金芽孢杆菌菌株 利用分子生物学的技术鉴定和克隆具有新杀虫特性的杀虫晶体 蛋白基因 利用基因重组 结合转移等基因工程的手段构建新的或具有多重杀虫功效的苏 云金芽孢杆菌工程菌

2016/11/1
苏云金芽孢杆菌
苏云金芽孢杆菌杀虫原理
产生芽孢时产生伴孢晶体 由几种晶体蛋白即δ-2内毒素组成 δ-2内毒素分为Cry和Cyt两类：Cry活体条件下只对双翅目幼虫 有毒,离体条件下具广谱性;Cry分为4种,CryI对鳞翅目幼虫有毒, CryII对鳞翅目和双翅目均有毒,CryIII对鞘翅目有毒,CryIV对双 翅目有毒。

2016/11/1
苏云金芽孢杆菌基因改造作物优点
苏云金芽孢杆菌基因改造作物有如下优点： 杀虫毒素释放量大，足以杀灭害虫 植物产生的毒素不会释放到外界，只有植食害虫才会进食死亡 产生毒素可由组织特异性启动子调控 抗虫性是依据孟德尔的遗传规律进行稳定遗传 毒素基因可装载在叶绿体基因中，因此排除了通过花粉传播的途径

2016/11/1
目前国内外对苏云金芽孢杆菌工程菌的改造主要集中在： 扩大杀改善土壤中的活性 提高毒力等

2016/11/1
农药真菌
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真菌能作为昆虫农药的理论依据
真菌是昆虫病原微生物中最大的一个类群，已发现约有1000 种 自然条件下全部病死昆虫中约60% 因真菌致病而亡 与病毒、细菌通过胃毒杀虫的途径不同, 真菌主要通过昆虫体壁侵染昆虫, 可侵 染刺吸式口器的昆虫和处于非取食期的昆虫卵和蛹等 真菌侵染和致病机制复杂，害虫难以对真菌制剂产生抗性 对病虫害的持续控制作用, 可以形成昆虫间的流行病 对哺乳动物毒性低, 对环境的影响小
传统酵母转化系统

先使纤维素酶基因与表达载体相结合，再将重组体转入酵母细 胞内形成转化子，表达目的基因，从而产生纤维素酶蛋白，这 是传统酵母转化系统。目前有 2种方法可以使酵母细胞摄取外 源 DNA ，即原生质体转化和完整细胞转化。现在采用较多的 是完整细胞转化的方法，该方法是1983年发展起来的。此方法 虽然要用Li离子处理细胞，但和原生质体转化方法相比，则比 较简单，在筛选转化子时，不必进行细胞壁再生，而且Li离子 处理完整酵母细胞的转化率比原生质体的高。但必须用聚乙二 醇处理转化细胞，否则转化率会大幅度下降。