第三章植物基因克隆的载体
命名举例
• pBR322是最早构建的质粒之一 • “p”表明它是一个质粒 • “BR”表示最初构建它的两个人的名字首字母：
Bolivar和Rodriguez • “322”区别于该实验室构建的其他质粒，如
pBR325、pBR327等
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三、质粒的基本特性
第三章植物基因克隆的载体
（二）质粒的命名原则
➢质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转 移性或亲和性差异划分为不同的类型。 ➢最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特 征自行命名，如F因子(fertility factor，致育因子)、 R质粒(resistance factor，抗性质粒)和Col质粒 (colicin，大肠杆菌毒素质粒)等。
第三章 基因克隆载体 Vectors
第三章植物基因克隆的载体
一、载体的概念
载体(vector)：在基因工程中，携带目的基因或 DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA 分子。 作为载体使用的必须是能进入植物寄主细胞内 进行复制和表达的核酸分子。
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二、载体的功能
1、 运送外源基因高效转入受体细胞； 2、 为外源基因提供复制能力或整合能力； 3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
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三、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的 利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低长度），建立多克 隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克 隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7， sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。
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四、分类
按载体性质分
质粒载体、噬菌体载体和人工染色体
目前发展起来的植物基因转移的载体系统分为两大 类：
一是病毒载体系统 二是质粒载体系统
➢随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质 粒的微生物新类群和新质粒被发现，但由于缺乏 统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。
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（二）质粒的命名原则
➢直至1976年Novick等才提出一个可为质粒研究者 普遍接受和遵循的命名原则。
➢其规则是： ➢质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第 一个字母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可 以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他 特征的英文缩写。 ➢编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不 同质粒，如pBR322、pUC18和pUC19等。
3、质粒的存在形式
• 生理条件下：以共价闭合环状DNA分子(Covalent close circular, ccc-DNA)形式存在
体外理化因子作用下可形成下列形式 开环DNA分子(oc-DNA) • 线性DNA分子(l-DNA) • 超螺旋DNA分子(scDNA)
• 在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子 （ss-DNA）。
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二、质粒的发现和命名
（一）质粒的发现
➢在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒， 且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的 范围。 ➢70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己 被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很 多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能 分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。
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（4）质粒空间构型与电泳速率
同一质粒尽管分子 量相同，不同的构 型电泳迁移率不同： scDNA最快、 l DNA次之、 ocDNA最慢。
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三、质粒的基本特性
（5）自主复制性
携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
一、质粒(plasmid)
独立于细菌染色体外的 能独立复制的双链闭合 环状DNA分子
• 细菌中发现，偶见于 链霉菌和酵母
• 比病毒还简单的亚细 胞结构，一旦离开寄 主细胞则无法繁殖第三。章植物基因克隆的载体
大肠杆菌的质粒
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二、质粒的发现和命名
（一）质粒的发现
➢1946年，第一个被发现的细菌质粒是大肠杆菌 的F因子，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深 远的影响。 ➢1957年，日本学者报道了志贺菌(Shigella)中 质粒介导抗生素抗性的转移现象。
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（6）不相容性
同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相 容，不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存
（7）可扩增性
质粒就其复制方式而言分为两类
松弛型复制 严谨型复制
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（8）可转移性
在天然条件下，大多质粒可通过细菌 接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一 种宿主内。
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五、基因工程载体必须具备的条件
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
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第一节 质粒载体
（1）质粒分子较小
一般为1-200Kb，最大的可达1400kb(如苜 蓿根瘤菌质粒pRm141a)。
（2）编码特性——表型多样化如抗生素的抗性、产生抗Fra bibliotek素、降解复杂有机
化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、
合成限制性内切酶或修饰酶、生物固氮和杀虫
等。
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三、 质粒的基本特性
非结合细菌可通过人工方法进行转化
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四、质粒与宿主细胞的关系
（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居” 在宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，
宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。