3）RNA中沾染了基因组DNA 4）镁离子浓度太高
建议解决方法： 优化镁离子浓度。
5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法： 使用巢式PCR或递减PCR。
RACE PCR
PCR和细胞内DNA复制的相同点：
（1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为 模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链 是新合成的
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differenti 4、 DNA 结合蛋白基因的分离
a
b
建库法
cDNA Library
• 传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真 核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因 此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA 反转录成cDNA。
• 该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2 个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游 引物，称3’-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出 polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又 设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR 扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表 一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某 种细胞类型 structure
Promoter region Core promoter
● -75 -25 0 ATG
DNA 结合蛋白
转录因子的两个主要结构域：
a. DNA结合域 -DNA binding domain，简称DNA-BD，它可
识别效应基因上游的一段特定的区段， 即上游激活序列 (up-stream activating sequence, UAS)，并与之结合。
Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met 1 2 22 2 1
(16 species)
p176
Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn 6 2 26 42
(1152 species)
RT-PCR and RACE PCR
Reverse Transcription,
Rapid Amplification of cDNA Ends
建议解决方法： 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变
性/退火. 提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃ ，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应 温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应 温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differenti 4、 DNA 结合蛋白基因的分离
5、信号传递蛋白基因的分离 6、图位克隆技术（Map-based cloning）
利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它 植物中克隆同源基因
注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。
2、利用protein信息分离基因 前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化
Antibody production Construction of Expression Library
算Tm值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。 9）富含GC的模板
建议解决方法： 对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx
Enhancer Solution。
问题2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 原因： 1）引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退 火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。 2）引物设计较差 避免在引物3‘端含有2到3个dG或dC。
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转 录因子通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调 控蛋白相互作用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂 交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。
• GAL4的DNA结合域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳 糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域可与RNA聚合酶或 转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在这一过程中， DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.据此，我 们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们 想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域 激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
● 利用protein测序的氨基酸信息
Probe (oligonucleotides) Primer (degenerated primer)
(b) Oligonucleotide probes or generated primers for genes whose translation products have been characterized
6）PCR引物设计较差
建议解决方法： 避免在引物3‘端含有互补序列。避免可以形
成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 7）镁离子浓度太低
建议解决方法： 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应
，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
8）退火温度太高
建议解决方法： 把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为公式估
（2）两者都需要引物 （3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶 （4）两者的底物都是dNTP （5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对
原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键 （6）两者新合成链延伸的方向都是5’to3’ （7）两者DNA合成的保真度（精确性）都较高
PCR和细胞内DNA复制的不同点：• 从基因的功能上看可分为克隆及表达。
• 克隆由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择 标记，可通过细菌具有控 制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在 宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。表达载体又有融合蛋白 表达载体及天然蛋白表达载体之分。
• 正是基于这一理的报告质粒。
• 首先将报告质粒整合入酵母基因半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在
反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR
在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而
b. 转录激活域 -Transcriptional activation domain，简称AD，
它通过同转录机(transcription machinery)中的其它成分 的结合作用，启动UAS下游的基因进行转录。
酵母单杂交 Yeast one-hybrid system
• 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细 胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基 因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结 合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析. 运用此技术，能 筛复杂的蛋白质分离纯化 操作 。
植物基因克隆方法
隋娜 山东师范大学生命科学学院
• 一、基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、
连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形 成大量子代分子的过程。
• 二、基因克隆的核心---体外重组 (Recombination) 人工将一段目的DNA插入一 个载体的过程。
（二）未知 Gene products 的基因分离
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differenti 4、 DNA 结合蛋白基因的分离 5、信号传递蛋白基因的分离 6、图位克隆技术（Map-based cloning）
• 将 差 别 表 达 条 带 中 的 DNA 回 收 ， 扩 增 至 所 需 含 量 ， 进 行 Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条 带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因 。
mRNA 差异显示 ( differential display)
表 达 文 库 法
PCR两条模板链通过变性完全打开双链 （5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成
可能不同步 （6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合
酶一般不耐热 （7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的 （8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
（一）已知 基因产物ห้องสมุดไป่ตู้的基因分离 （二）未知 基因产物 的基因分离
（一）已知 Gene products 的基库
● 同源(homologous)DNA探针
为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。
● 异源(Heterologous)DNA探针
基因克隆的路线
载体DNA （vector）
DNA 重组
目的DNA （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
用何种方法取决于基因产物（Gene products）的 丰度以及gene的相关背景知识，
如 gene or its protein 的表达模式及初级结构等