实验五人的外周血淋巴细胞培养
一、实验原理
外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。

这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。

本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

二、实验目的
掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。

三、实验材料
人的外周血。

四、实验器具和药品
1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。

2．器皿的清洗和消毒
玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。

将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。

隔离衣、口罩。

橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。

3．药品
(1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。

每1000ml溶液加NaHCO，
1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。

立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。

(2) 肝素：作为抗凝剂使用。

称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。

高压消毒8磅15min。

(3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。

称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。

使用时用1ml注射器吸取该溶液0。

05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。

(4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。

提取PHA的方法有两种。

一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。

如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。

盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。

取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。

先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。

置冰箱24h。

然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。

酒精乙醚提取法：四季豆50g，先用生理盐水洗净。

将豆浸入60ml盐水中，保存于4℃冰箱内，24h 后用组织搅碎器将其磨成匀浆，再加140ml盐水，置4℃冰箱中24h，取出后以6000转／min离心20min，吸取上清液，调pH至5.6(用0.1mol／L HCl调)之后，每100ml上清液加40ml无水酒精，加以搅拌，以3000转／min离心15min，取上清液，弃去沉淀。

在每100ml上清液中加170ml10％乙醚无水酒精(10ml 乙醚十90ml无水酒精)以3000转／min离心15min，取沉淀放入培养皿中，在含有硅胶的抽气干燥器中抽气2—4d，沉淀物逐渐变得干硬。

将沉淀物研磨成粉末，以0.85％NaCl液配成1％的溶液，此PHA溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中，冰冻保存。

使用时每5ml培养物加0.1ml即可。

如果在得到沉淀物后的干燥及研磨等过程中充分保持灭菌操作，那么配成的PHA溶液便无需用细菌滤器过滤。

(5)抗菌素
青霉素(以每瓶40万U为例): 以4ML生理盐水(或培养基)稀释，则每ML含10万U。

取1ml加入100ml培养基中，则最终浓度为100U／ml。

链霉素(以每瓶50万U为例)：以2ml生理盐水(或培养基)稀释，则每ml含25万U。

取0.4ml(含10U)加入1000ml培养基中，则每ml含100U(即100μg)。

(100万U=lg，lg=1×106μg)。

(6)姬姆萨染液：0.5g姬姆萨粉末，加33ml纯甘油，在研钵中研细，放在56℃恒温水浴锅中保温90min，再加入33ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色细口瓶中保存，作为原液。

用时以磷酸缓冲液(pH7.4)1：10稀释。

(7)0.1mol／L磷酸缓冲液：pH7.4—7.6
A. Na2HPO4·12H20 28.8g
KH2PO4(无水) 2.67g
溶解于1000ml双蒸水中。

B. Na2HPO4·7H20 2.164g
NaH2PO4·2H20 0.3g
溶解于1000ml双蒸水中。

五、实验步骤
1．培养液的分装：在无菌室或接种罩内，用移液管将培养液和其它各试剂分装入培养瓶，每瓶量为：培养液(RPMIl640或M199) 4ml
小牛血清lml
PHA 0.2ml
肝素0.05ml
双抗(青霉素加链霉素)培养液中最终浓度各为: 100U／ml
用3.5％NaHCO3调pH到7.2—7.4，分装到20ml的玻瓶中，用橡皮塞塞紧，待用或置于0℃条件下保藏。

用前从冰箱内取出，放入37℃恒温锅中温育10min。

2．采血：用2ml灭菌注射器吸取肝素(500U／ml)0.05ml湿润管壁。

用碘酒和酒精消毒皮肤，自肘静脉采血约0.3ml，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内(内含有生长培养基5ml)接种，轻轻摇动几次，直立置37℃±0.5℃恒温箱内培养。

3．培养：置37℃温箱内培养66—72h。

4．秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度为40μg／ml的秋水仙素0.05—0.lml，最终浓度为0.4—0.8μg／ml，置温箱中处理2—4h。

5．低渗处理：低渗液的种类较多，如0.075mol／L的KCl溶液，0.95％的枸橼酸钠溶液，用蒸馏水稀释4倍的Hanks液，也可直接用蒸馏水。

秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液5毫升，用滴管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中置37℃温箱内处理20min，使红细胞破碎，白细胞膨胀。

6．离心:以每1000rpm/min，离心5min，弃去上清液，收集白细胞。

7．固定：固定液为甲醇：冰醋酸：3：1。

每只离心管中，加入固定液2－4ml，片刻后用滴管轻轻冲
打成细胞悬液，在室温中固定15min后，离心，吸弃上清液，留下白细胞。

8．再固定：加入固定液2ml，用吸管轻轻打散，室温下继续固定15min(过夜也可以)。

9．再离心：除去上清液，留下白细胞制片。

10．制片:向上述离心管中滴入固定液0.5毫升，用滴管小心冲打成悬液，从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片，每片滴加悬液1—3滴，用嘴轻轻吹散，用电吹风吹干，或在酒精灯火焰上微微烤干。

11．染色：用磷酸缓冲液(pH7.4)稀释后的姬姆萨染色液染色20min，然后倒去染液，用蒸馏水轻轻冲洗。

12．镜检：待稍午后，在显维镜下检查。

先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。

13. 封片：用加拿大树胶封片。

选择染色体清晰，分散度好的细胞进行显微摄影，进行核型分析(见图20—1)。

图20-1 人体外周血培养与染色体标本制作示意图
六、实验注意事项
1．接种的血样愈新鲜愈好，最好是在采血后24h内进行培养，如果不能立刻培养，应置于4℃存放，避免保存时间过久，会影响细胞的活力。

2．在培养中成败的关键，除了至为重要的PHA 的效价外，培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。

人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37+0.5℃。

培养液的最适pH7.2—7.4。

3．培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡厂使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。

4．制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开；可将固定时间延长数小时或过夜。

七、实验结果
1．
核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY 女子是46，XX(见图20—2)。

图20-2 人淋巴细胞染色体(46, XY)
求取以下三个参数：
(1) 染色体的相对长度=染色体长度
条条常染色体总长单个染色体长度X 1221000+⨯ （2）臂比率=短臂长度
长臂长度 （3）着丝粒指数=
100⨯染色体全长短臂长度 可以将人的46条染色体分成A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 七组，作为进一步识别和鉴定染色体的依据。

参考文献
项维，吕曼硎，7(1963)，《科学通报》，科学出版社，北京。