2‘，3’ddNTP与普通dNTP不同之它们可以在DNA聚合 酶作用下通过其5‘ 三磷酸基团掺入到正在增长的 DNA链中，但由于没有3’羟基，它们不能同后续的 dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA链不 可能继续延伸。

在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的 一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但却十分特异 的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链 ，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到 出现过早链终止的位置之间的距离。
测 序 结 果 输 出
长片段测序策略
BI-DIRECTIONAL SEQUENCING
5' 3' 3' 5'
IRD700
IRD800 Two Pห้องสมุดไป่ตู้imers/Template
2000 bases TTCAGAC-----------------PRIMER PRIMER------------------AAGTCTG
SBS Options

Minimum overlap
Largest single strand coverage Inserts ~ 2 kb
1 2000 Bases

Maximum overlap
Confirmed sequence in one tube Inserts of 1200 bases
1 1000 Bases
长片段的正反向测序
Side View
测 序 硬 件
Gene ReadIR DNA Analysis System Long ReadIR DNA Sequencer
BIOTECHNOLOGY DIVISION
Software
Multitasking Base ImagIR Software

Contrast to 4 colors No software interpretation of dye spectra
检 测 效 果 分 析 比 较
Detection Limits
DYE
IRD Fam Hex Tamra Rox 50 150 250 250 100 200 400 800
在4组独立的酶反应中分别采用4种
不同的ddNTP，结果将产生4组寡核 苷酸，它们将分别终止于模板链的 每一个A、每一个G或每一个T的位置 上.
DNA双脱氧法测序的原理及方 法

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双 脱 氧 法 测 序 的 原 理
单击查看DNA测序的动画演示
DNA
Seqamit.exe

总结

单击查看DNA测序原理过程和策略
四 色 荧 光 分 析 检 测

With 4 colors it is difficult to distinguish between a strong signal in one color or a weak signal in a second color No dye mobility shift corrections
SO3 X
Abs. Max.: 685nm Em. Max: 705nm Molar Absorptivity: 170,000 m-1 cm-1 Quantum Yield: 50%
Independent Channels
Dyes
are separated by 110 nm Detector filters eliminate signal crossover Lasers excite only one dye at a time
3Data=Accuracy
DNA测序的应用
Sequencing Mutation Screening Mutation Analysis Forensic Human Identification Mapping Studies Primer Extension Footprinting
DNA Analysis Systems
IRD 800
荧光标记染料种类
O
N+
N
_
X SO 3
Abs. Max.: 787nm Em. Max: 807nm Molar Absorptivity: 200,000 m-1 cm-1 Quantum Yield: 16.5%
IRD 700
N+ N
_
DNA 测序的原理及方法
DNA
测序的原理 DNA测序的操作过程 DNA测序实例
Sanger法DNA测序的原 理
使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行 延伸反应、碱基特异性的链终止，以及采 用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸 的单链DAN等3种方法。引入双氧核苷三磷 酸（ddTBP）作为链终止剂（Sanger等， 1977 ），酶法DNA序列测定技术才得到广 泛应用。
377
(amole)
373
(amole)
LI-COR
(amole)
15
电泳带型检测
A
T G C
700
800
700 nm Laser
700 nm Detector
800 nm Laser
800 nm Detector
Signal Processing Computer
测序电泳图谱
Channel 700 Channel 800
常用测序方法

手工测序
• 读序长度: 约 300bp • 同位素32P, 35S标记 • 结果通过人工肉眼分析
氩离子激光器测序仪
• 读序长度: 500-700bp • 可见荧光 Fam, Hex, Rox, Tamra标 记 • 软件自动读序

红外激光器测序仪 • 读序长度: 1000-1400bp • 红外荧光标记 • 软件自动读序