研究生细胞生物学技术
--基本原理及实例应用
李真 西7-103 2015-10
一种观察工具，需要前面的实验做基础
免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染……
什么是LSCM 用来做什么
它和荧光显微镜的关系？ 它和电子显微分
显微镜（Microscope）
泛指将微小(分辨率0.2μM)不可见或难见物 品之影像放大 ,而能被观察的工具。
XYZ扫描 XYT扫描
胚胎的结构
切片分层叠加
单层面扫描
多层叠加
耳蜗基底膜
三 维 图 像 重 建
三 维 图 像 重 建
激光共聚焦显微镜的功能
✓ 使用能量稳定的激光作为光源，且各种参数可调。 ✓ 荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标
记蛋白的表达量成正相关。 ✓ 同一个光学条件下，应用相同的荧光探针，通过
优势
局限
高垂直分辨率
沿Z轴逐层扫描，经过计算机处理成为 三维图像。
高水平分辨率
• 人眼分辨率：0.20 mm • 光学显微镜分辨率：0.25 mm • 共焦显微镜分辨率：0.18 mm • 电子显微镜分辨率： 0.20 nm
共聚焦显微镜的分辨率理论极 限大约是0.15 mm，轴向分辨率 0.5 mm。
扫描
移动激光扫描器，逐点扫描
不在焦平面 的发射光
分光镜
物镜 激发光线
/theory/
荧光显微镜系统
一 次 性成 成像 像技
术 ，
CCD
X光机
样品
断层扫描技术， 逐点逐行扫描成像
CT机
激光扫描共聚焦系统
特点： 侧面有扫描器接口； 装有微量步进马达； 装有防振动装置； 装有光路转换装置； 配高数值孔径的物镜。
激光扫描共聚焦显微镜
Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM
--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检 测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描， 以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。
光源 光学原理 成像原理 基于的平台
激光 针孔的共轭聚焦技术
断层扫描 荧光显微镜系统
比对各组样品之间的荧光强度值，进行定量分析。
普通荧光显微镜
激光共聚焦显微镜
荧光显微镜 目镜或CCD—真彩色
所见即所得 单通道荧光采集
激光共聚焦
PMT检测器—伪彩色
灵敏度高
光信号-电信号-图像 由计算机精确控制图像的合成和输出，
同时电信号增加放大倍数。
多通道荧光采集
一般3个荧光通道和一个透射光通道，分 别成像
荧光显微镜 VS 激光共聚焦显微镜 基于的平台—获取图像方式
• 荧光显微镜
光源
• 汞灯 • 卤素灯 • 其他普通光源
• 激发波长范围广
特点
• 激光共聚焦显微镜
• 激光 光源
特点
•光色纯 •方向性好 •能量可调
检测器
分光镜 物镜
光源
标本
荧光显微镜
检测针孔
光源针孔
激光共聚焦扫描显微镜
点光源
位于焦平面 的发射光
激光器
双针孔 光源针孔、检测针孔
共轭聚焦 双针孔共用物镜的焦点
通道同时探测。
海 马 D G 区
牛精子
藤黄微球菌
绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子
绿色：活菌 红色：死菌
拟南芥，By Heiti Paves, Centre of Excellence ENVIRON, Estonia 斑马鱼神经元系统， by Albert Pan， Harvard University 视网膜烟花，by Josh R. Sanes, Harvard University
目镜
物镜
光阑和聚光器 聚焦旋钮 光源
载物台
用于研究荧光或荧光标记物质的光学显微镜。
照相装置
基本原理
分光镜 (长通短反)
物镜
标记了荧光的样品
光源（汞灯）
高压汞灯
滤镜分光
紫外、蓝、绿
激发
被荧光探针染 色的生物样本
光学成像
被标记结构的 荧光光学图像
共聚焦显微镜成像
针孔（pinhole）
标本
物镜
焦平面
伪彩色
--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚 焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片 的荧光显微镜系统。
将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术 结合在一起的高技术设备。
激光/光学显微镜结合，高灵敏度探测器，高性能计算机/ 图像处理软件相结合的新型高精度显微成像。
激光共聚焦显微镜的功能
在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，
并进行精细逐点扫描成像，获得高分辨率图像。
ZOOM成像
尽量使
用高数
值孔径 油镜！
激光共聚焦显微镜的功能
通过调节针孔的大小，控制样品扫描层面的厚度， 可逐层获得高分辨率的光学横断面图像。 并可用计算机软件后期合成去除非交信息的三维立 体图像。
1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消 除焦点模糊，得到清晰的图像，至此LSCM技术基本成熟
1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显 微镜
目前常见的激光共聚焦显微镜
激光光源
荧光 显微镜系统
扫描器系统
计算机图像存 储与处理系统
Zeiss LSM-710 Confocal System
展现最清晰成像细节
By George von Dassow, University of Oregon
高清晰成像
小 鼠 神 经 元 细 胞
激光共聚焦显微镜的功能
普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多 种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。
激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多
第二部分
薄层光学切片
多通道同时扫描 ZOOM成像 多维度成像 荧光定量分析 ……
激光共聚焦显微镜的功能
使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，
减少了成像的干扰。
使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可
达普通光学显微镜的1.4倍。
逐点扫描，形成光学切片
展现最清晰成像细节
牛 肺 上 皮 细 胞
观测厚度（60X）：50-100 mm
一次只获得某一层面的图像信 息
共聚焦显微镜是逐点成像，成 像速度较慢
1957年，Marvin Minsky在他的专利中首次阐明了激光扫 描共聚焦显微镜技术的基本工作原理
1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了 一个光学横断面
1970年， Sheppard 和Wilson推出第一台单光束共聚焦激 光扫描显微镜问世