.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。
同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。
可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。
一般常用的气体激光器如氩(Ar) ﹑氪(Kr) ﹑氦(He)﹑氖(Ne)。
illuminating pinhole:照明针孔功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detectorpinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后,通过物镜在样品聚焦。
对标本内焦平面上的每一点进行扫描,Focal plane:焦平面功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。
共聚焦的含义由此而来。
标本上的被照射点所发射的荧光沿同一光路进入物镜, 穿过分光镜后在探测针孔处成像, 该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。
然后经探测针孔后的光电倍增管(PMT) 或冷电感耦合器件(cCCD) 逐点或逐线接收,将光信号转变为电信号，传输至计算机，迅速在屏幕上形成荧光图像。
关键在于：照明针孔与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o m通过调节分光镜（一般是调节反光镜），调节光路，使激发光的焦点恰好通过探测器针孔，随后进入光电倍增管。
不在针孔处聚焦的光不能通过。
生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mLSCM 对生物样品的观察的优越性：ž连续扫描三维ž离子荧光标记ž同时多重物质标记在对生物样品的观察中,激光共聚焦显微镜有如下优越性:①对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描,可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。
②用荧光标记细胞内的离子,可以单标记一种离子也可以多标记几种离子,检测细胞内如pH 和钠、钙、镁等离子浓度的比率及动态变化。
③用荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,通过对膜上、胞浆内多种免疫物质的标记，可以实现在同一张样品上同时进行多重物质标记,同时观察这些物质;④对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠、重复性优良; 数据图像可及时输出或长期储存。
生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o m秀-专心做生物w w w.i o o.c om生物ž激发光和发射光都通过滤片来调节波长，滤片是成对的，调节起来很方便。
（左）ž科学研究工作对更高图像分辨率的追求产生了激光扫描共聚焦显微镜。
随着免疫荧光技术在生物学研究领域的广泛应用,研究人员注意到,荧光显微照片的分辨率较低, 传统的荧光显微镜使用场光源,因标本邻近结构(细胞或亚细胞结构) 产生的衍射光和散射光的干扰,使标本中细微结构的成像不够清晰。
ž早期的激光扫描共聚焦显微镜采用的是扫描速度较快的狭缝扫描方式,由于其在平行狭缝的光轴面上无共聚焦原理,图像分辨率不高,而被淘汰。
随后发展起来的是阶梯式扫描技术,它克服轴外像差,平行移动工作台来逐点扫描标本,提高了图像分辨率,但是对标本制备要求太高,也难于成为成熟的技术。
现在的激光扫描共聚焦显微镜采用的是驱动式光束扫描器,具有扫描速度较快和符合共聚焦原理的特点。
ž目前激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进。
首先是激光器的快速发展,使得现代的激光扫描共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器。
选择激光光源时,一方面要满足研究工作对波长的需求,另一个方面要考虑到激光光源的寿命。
其次是近年来对于激光束分光和荧光采集原理也有较大的突破,目前大部分激光扫描共聚焦显微镜仍采用选择性波长滤片轮进行分光和荧光采集(左图) ,这样的装置完全与传统的荧光显微镜一样使用激发波长滤片和吸收波长滤片来完成对不同的荧光标记进行选择性的成像。
ž最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术（右图）,配上合适的激光源后,能够摆脱传统的波长滤片组的限制,连续和自由地选择最佳波长) ,这一特点对于现在和未来开发出的各种新的荧光标记物(特别是各种荧光蛋白和荧光染料) 和研究动植物的自发荧光物质有很高的价值,从某种意义上,这一技术革新已使新一代激光扫描共聚焦显微镜超脱了传统的荧光显微镜系统。
与此同时用于激光扫描共聚焦显微镜的物镜也做了较大的改进,可以与高速扫描功能相匹配。
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m心做生物b i o o.co mž在细胞原位用特异探针标记出核酸,蛋白质,多肽,酶,激素,磷脂,多糖,受体等分子ž并用激光扫描共聚焦显微镜成像,从而实现上述大分子的定位,定性及定量检测生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m隙连接通讯脂肪DAPIž常用的荧光探针:ž1 荧光染料FITC:蓝光激发,发出明亮绿色荧光ž2 罗丹明: 比FITC 光稳定性好,在生理条件下对PH 变化不敏感,荧光强度受细胞自发荧光的干扰较小生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž通常用的方法:ž1 细胞核形态观察ž2 脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)ž3 Annexin-V 试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m秀-专心做生物w w w.b bi o o.c om生物ž不同实验目的,标记细胞器的方法也不同.1线粒体MitochondriaRodamin 123Mitotracker Green FMMitotracker Orange CMTMRosMitotracker Orange 2 溶酶体Lysosome 中性红AO LysoTracker Green DND-26 / Blue/ Red 3 内质网Endoplasmic ReticulumDiOC64高尔基体Golgi apparatusNBD C6-ceramie生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mž根据不同细胞的特性,将每一种细胞特有的物质用不同的荧光控针标记;ž融合操作后,确认不同的荧光信号是否发生共定位于同一细胞;ž如在同一细胞中同时检测到上述不同的荧光信号,则说明已经发生了细胞融合.生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mž骨架(微丝,微管和中等纤维)直标: 一抗+荧光探针(如:肌动蛋白actin )间标:二抗+荧光探针(如:微管蛋白tublin)生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m肌动蛋白(Actin)标记肌动蛋白是微丝的基本成分毒伞素(鬼笔环肽)---与多聚体肌动蛋白微丝专一性结合起来且亲和作用强烈.生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om微管蛋白(Tubulin)标记生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c omž染料荧光黄(LY)---黄色带电荷的小分子强荧光物质,不通过细胞膜,但可以很容易通过GJIC,从标记的细胞(划痕法)传输到邻近细胞.ž观察LY向邻近细胞的传输速率,用以表示GJIC连接通讯功能生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om漂白细胞(箭头标记)荧光漂白前(A)及漂白后0(B)、2(C)和4(D)min 时的荧光恢复情况经瞬间漂白后细胞内荧光强度明显变弱．随着时问的推移．荧光逐渐恢复，至4 min 时(D)．可见荧光强度明显恢复．FRAP 法测定膀胱平滑肌细胞GJIC 功能生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž尼罗红(Nile red):是一个理想的脂肪染色剂,它只在疏水环境中显示很强的荧光.除了在所需显示的脂质中被溶解外,尼罗红与组织不发生任何反应.生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c omž利用相应的特异荧光控针标记后ž观察单个细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变化过程生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c omž(一)实时定量测定细胞内Ca2+的变化ž(二)测定细胞内PH 变化ž(三) 检测膜电位的变化ž(四)检测细胞内活性氧物种的产生ž(五)检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位ž(六)检测荧光共振能量转移(FRET)ž(七)检测荧光漂白恢复(FRAP)生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž基本原理:ža 其乙酰羟甲基酯(AM)形式是Fluo-3AM,无荧光,为不带电荷的亲脂性化合物,易于渗透脂膜进入活细胞内žžb 在胞内被非特异酯酶水解,释放出游离酸形式的荧光探针分子,此游离态也无荧光,不易漏出胞外žc 一旦与Ca2+结合后便形成复合物,并有较强的荧光产生,从而发挥其钙探针的作用.生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mKCLKCL生物秀-专心做生w ww .b b i o o .c o mž常用的荧光探针有BCECF 和6-COFDAžBCECF 的激发光谱是PH 依赖性的ž比例法:即分别用490nm 和440nm 光激发BCECF 所得到的发射荧光之比(比例荧光与PH 有很好的线性关系)ž最大分辩率为0.4PH 单位.生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž快响应探针: 膜电位直接影响探针分子的电分布而改变其光谱,响应快ž慢响应探针: 主要通过改变其在膜内外的分布来对膜电位的变化作出反应.跨膜运动需要一定的时间,所以反应慢.依探针对电位变化响应速度,将电位敏感探针分为快响应探针和慢响应探针生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž基本原理:ža DCFH-DA 进入细胞后žb 经酯酶作用脱去二酯,生成不发荧光的DCFH žc 被超氧阴离子,过氧化氢等活性氧化生成发荧光的DCF žd 活性氧自由基的含量与荧光探针之荧光强度成正相关DCFH-DA 常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž为检测药物分子,病毒,细菌等外界物质能否跨膜进入细胞/组织,需利用这些物质特异性自发荧光/对其进行荧光标记.生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c omž由于荧光蛋白的独特优点,其特定的荧光对理论上可用于活细胞中实时研究大分子间的相互作用.生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om供体荧光素受体荧光素生物w w wžFRAP:是将待测细胞用荧光物质标记,借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域,从而造成该区域荧光分子的光淬灭;通过低强度激光扫描成像,可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率.ž从理论上讲,凡是能够标记待测分子,并且能够发生荧光淬灭的荧光物质都可以使用.生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mIntensityBefore bleach After bleach90 min after生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o m多光子激光扫描显微镜—Multiphoton Laser Scanning Microscopy ž在生物及医学成像,单分子探测,三维信息存储,微加工等领域得到广泛应用,展示了广阔的发展前景.生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m1.多光子激光器波长从700-1000nm 连续可调双光子波长：350-500nm 连续三光子波长：230-330nm 连续应用：可直接清晰活体观察某些非标记神经递质的分泌(5-HT ) 或NADPH 的分布生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m秀-专心做w w w.b bi o o生物ž优点:ž1 对生物样品的光损伤小ž2 有效观测时间长ž3 穿透深度深ž4 荧光收集率高ž5 对探测光路的要求低ž6 适合多标记复合测量ž局限:ž1 只能对荧光成像ž2 样品可能受到热损伤.(若样品含吸收激发光的色团,如黑色素)ž3 超快激光器较为昂贵生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om秀-专心做生物w w w.b bi o o.c om生物。