从产热斑叶阿若母中纯化的交替氧化酶与丙酮酸的相互作用关键词：交替氧化酶，作用机制，丙酮酸调节，酶的稳定性，二铁羧酸盐蛋白，产热作用摘要：植物离体线粒体的交替氧化酶活性被羧酸调控，但是反应和调控机制还不清楚。
我们的研究表明，从产热斑叶阿若母肉穗花序中纯化的AOX蛋白对丙酮酸和乙醛酸敏感，对琥珀酸不敏感。
缺乏丙酮酸时，AOX迅速的不可逆的失活，不管杜氢酸是否开始氧化，AOX 对杜氢酸不敏感。
数据表明，丙酮酸能稳定AOX的活性构象，以单独地减少底物和产物的方式增加活性蛋白的数量，这丙酮酸对酶的表观最大速率的独特作用是一致的。
1、介绍AOX是非电子激发的醌氧化酶，它位于高等植物、真菌和某些寄生虫（包括布氏锥虫和隐孢子虫）线粒体中。
虽说两个独立的电磁共振研究证明AOX的活性中心由双核的铁中心组成，AOX的结构和机制已经被全部建立。
近期具有说服力的傅里叶变换红外光谱学的证据坚定地把AOX归入了膜结合二铁羧酸蛋白这类蛋白中。
一项重要的发现表明，从植物中分离得到的线粒体表明某些羧酸强烈激发AOX的活性。
在非产热物种的线粒体中，例如从大豆子叶和烟草叶中提取的线粒体AOX的活性完全依赖丙酮酸的参与。
乙醛酸和其他的α-酮酸能代替丙酮酸，同时，琥珀酸可以代替丙酮酸激活土豆和产热的莲中的AOX。
从产热的斑叶阿若母肉穗花序中分离的不仅表现出丙酮酸可促进得活性，还在产热增加过程中表现出丙酮酸不敏感的基本AOX的活性。
据推测，AOX和丙酮酸分子间的相互作用出现在邻近的两个关键的Cys形成含硫半缩醛时，这两个关键的Cys在许多丙酮酸敏感的AOX酶中都是保守的。
人们推测，这个含硫半缩醛引起点位诱导的构象变化，这种构象变化对于激活AOX是必要的。
如果用Ser替代了Cys，那么这种同功酶将不会被丙酮酸激活而被琥珀酸激活。
最重要的是，我们目前对于斑龙芋AOX的研究暗示，一系列保守序列元件很可能参与丙酮酸的结合作用。
尽管，AOX和丙酮酸分子间的相互作用的结构研究有一定的进展，但是，具体丙酮酸激活AOX的机制还不清楚。
人们观察到，只有线粒体泛醌库高度诱导的情况下丙酮酸才激活AOX，因此断言，丙酮酸增强了AOX与其还原底物的相对亲和力。
自从张等发现用丙酮酸纯化AOX，人们一直争论丙酮酸对于AOX的最大活性具有专一性。
为了把这两种观察结果解释清楚Hoefnagel 和Wiskich假想了一个模型，模型中丙酮酸通过自身的氧化泛醌产物保护酶免受失活。
我们认为用实验验证这条假说非常重要。
在这篇论文中我们阐明了AOX调控，我们用的是从斑叶阿若母肉穗花序中提取的活性高、稳定性好的AOX。
我们研究表明，纯化的产热的AOX的杜氢醌(DQH2)的氧化活性对于丙酮酸和乙醛酸敏感，而对琥珀酸不敏感。
这种敏感性是由于缺乏丙酮酸引起的不可逆的酶失活。
这种失活不需要DQH2氧化，而且对DQ的形成不敏感。
因此，我们的研究结果表明，丙酮酸通过单向的减少底物和产物来稳定AOX的活性，同时，也支持了a-酮酸对于AOX的表观Vmax具有独特的影响的观点。
2、材料和方法2.1化学药品N,N-Bis deoxycholamide是从ICN Pharmaceuticals购买的，其他的药品都由Sigma供应。
2.2AOX纯化如上所述，AOX是从产热的阿若母线粒体中提取纯化的。
简单来讲，AOX是从产热的阿若母肉穗花序中提取的，加入2 mM的丙酮酸，-20 °C冷冻，-70 °C保存。
纯化时，经证实，线粒体的活性在保存过程中全部保留。
通过冻融渗透震动线粒体得到亚线粒体粒子(SMPs)，然后根据上述方法提纯AOX。
AOX从deoxyBIGCHAP中溶解，然后用DEAE sepharose-based色谱分离提纯。
AOX用0.5% w/v deoxyBIGCHAP洗脱。
值得注意的是，纯化介质中都含有丙酮酸和DTT。
将AOX样品分装储存于-80 °C备用。
样品至少可以保存活性一年，表现为对没食子酸辛酯非常敏感而对粘噻唑不敏感。
2.3实验AOX的活性用色谱级的氧吸收测定，或者用分光光度计同时测定氧化、还原DQ的浓度，2-甲基氨基乙磺酸-氢氧化钠PH6.8。
所有实验都在D介质中有机酸中或缺乏有机酸的条件下完成的。
用连二亚硫酸钠还原DQ 制备DQH2。
DQH2固体要室温避光保存，使用时用酸化乙醇重悬。
储存浓度要用分光光度计测定以下消光系数：DQ酒精溶液在259 nm 为17.8 /(mM*cm)，DQH2水溶液在283 nm 为2.15/(mM*cm)。
在DQH2氧化实验中，没有用DTT作为标准物，防止DQ被DTT还原。
所有实验中AOX的共价二聚体的状态没有改变。
氧消耗是用Clark型氧电极在室温下测得的。
数据用装有Chart 3.6s版软件的PowerLab/4SP 系统进行数字化记录。
AOX被加入到1 ml的D介质中，随后有机酸从100倍的储存中加入25 mM Tes-NaOH溶解PH6.8，加入250µM DQH2后反应开始。
对于光谱测量实验，时间决定的吸光度值用Cary 400 Scan UV–Visible吸光光度计在250和290 nm处测得，像先前描述的一样，实验进展曲线是准初始速率的数倍。
250nm DQ的消灭系数7.10和0.534 /(mM*cm)，290nm DQH2的消灭系数是0.334和1.62 /(mM*cm)。
所有实验都是在能用于磁力搅拌的半微量比色皿中，在20 °C恒温箱中进行的。
如图例所示，AOX的活性是在丙酮酸参与或者缺乏的情况下在700 µl的介质D中测量的。
在添加AOX 或250 µM DQH2后反应开始。
3、结果与讨论3.1纯化AOX的活性依赖各种有机酸首先，我们根据各种孵育条件下AOX依赖的耗氧量来研究纯化的AOX对于丙酮酸和其他有机酸的依赖性。
我们或其他的科学家之前的研究表明，纯化的AOX需要结合去污剂(EDT-20)和丙酮酸才能保持完整的活性，二者缺一就会降低AOX的活性。
Fig. 1A呈现出的结果证实了这一见解，在EDT-20的参与下，丙酮酸或乙醛酸是AOX介导的耗氧速率约提高8倍。
然而，琥珀酸对其没有明显的作用。
乙醛酸促进AOX的活性，不管丙酮酸和琥珀酸参与与否，往往会比丙酮酸单独介导的活性要高一点。
这表明，AOX对乙醛酸的敏感性比丙酮酸更高。
琥珀酸不会显著影响丙酮酸介导的AOX的活性。
特别有趣的是，用琥珀酸预孵化30s会阻止丙酮酸和乙醛酸介导的AOX的活性。
这个发现表明，AOX在丙酮酸或乙醛酸参与下是不稳定的；抑或表明，琥珀酸阻止了蛋白与丙酮酸和乙醛酸的相互作用。
3.2缺乏丙酮酸情况下，AOX不可逆失活，不考虑酶变化为了观察丙酮酸对纯化AOX的醌氧化活性的影响，我们下一步利用先前开发的分光光度计实验法同时测量DQH2的氧化和DQ的生成。
Fig. 2A显示在丙酮酸参与或缺乏情况下，时间决定的AOX对于DQH2的氧化。
当加入底物反应开始时，分光光度计测定的初始AOX 活性都非常相似，再加上或减去丙酮酸的作用。
缺乏丙酮酸是，随着底物的变化，AOX的活性会显著的丧失。
DTT不影响丙酮酸的作用表明了，AOX失活不是因为蛋白氧化造成的。
总之，这些观察结果表明，丙酮酸仍旧结合在AOX上，不管是纯化时，还是在丙酮酸被洗脱失活时。
接下来，我们在没有还原底物的情况下，孵育AOX±丙酮酸一段时间，来探索酶失活的可能的原因。
Fig. 2B的数据表明，孵育后AOX的活性下降明显，不管丙酮酸参与与否。
然而，在没有丙酮酸的情况下孵育90s后，AOX的活性下降到对照的10%，而在丙酮酸参与下从来没有降到60%以下。
Western分析结果表明，孵育过程中AOX的还原状态并没有改变。
Fig. 2B中显示的发现表明，丙酮酸对于未变性酶起稳定性作用。
这个观察结果似乎与先前的预期有分歧，之前，我们企图通过脱盐作用出去部分提纯AOX中的丙酮酸，之后在厌氧性环境中用乳酸脱氢酶孵育，结果AOX的活性仅仅降低了大约40%。
但是，由于准备和孵化阶段NADH-Q氧化还原酶对于NADH的活性，或者准备工作时的不同的液态环境，这种发现可能被维持酶结合醌的还原态混淆。
由于在提纯AOX时需要丙酮酸而推断存在非结构依赖性AOX失活现象。
不考虑酶自身结构的变化，酶活的半衰期大约为30秒。
尽管在同浓度的乙醛酸和丙酮酸中，AOX对于DQH2的氧化率，前者比后者高30-40%，潜在的反应了不同的亲和力和包括a-酮酸在内的氨基酸残基的微妙的变化，但是，用乙醛酸代替丙酮酸会出现同样的现象。
因此，似乎乙醛酸和丙酮酸与AOX的作用相似，目前，我们的数据不能排除这些a-酮酸再作用机制上有微小的差别。
另一方面，加入底物之前，用10mM 的琥珀酸孵育与用不加任何羧酸的缓冲液孵育相比，AOX的失活程度相同。
这表明，琥珀酸在保护酶免受失活方面没有任何作用。
可以确定的是，在丙酮酸敏感物种中分离得到的线粒体中，丙酮酸对AOX的激活作用是可逆的。
但是，在丙酮酸加入AOX中预孵化30s稳定其活性之后，除去纯化AOX中的丙酮酸，AOX就会发生不可逆的失活，而且不能恢复。
因此，AOX的活性完全依赖于丙酮酸（或其他a-酮酸）。
一个非常有趣的重大发现是，产热阿若母线粒体和SMPs中既有丙酮酸依赖的AOX也有非丙酮酸依赖的AOX。
这些差异可能是由于纯化样品中缺乏磷脂造成的，这暗示AOX在其自身的膜环境中是稳定的。
3.3AOX对于丙酮酸浓度的依赖性AOX初始速率对丙酮酸浓度依赖性的检测是不确定的，因为人们推断丙酮酸结合酶之后然后进行纯化，并且当移除丙酮酸之后，酶发生不可逆的失活。
AOX对于丙酮酸的相对亲和力通过以下方法估测：用不同浓度丙酮酸孵育酶2min，加入DQH2，测定AOX的活性。
通过这种方法得出，使AOX活性下降到最大活性一半(K1/2)的丙酮酸的浓度至少为0.5-1mM，不受琥珀酸的影响。
这个K1/2比从大豆和卷心菜亚线粒体颗粒中分离的AOX的K1/2高，可能又一次反应了纯化蛋白的环境不同。
但是，值得注意的是，我们的实验结果对DQH2的浓度没有依赖性，这表明，丙酮酸不影响AOX与还原底物和产物的相互作用。
3.4丙酮酸稳定纯化AOX的活性构象，不依赖醌产物丙酮酸缺乏而导致AOX失活，这个现象有两种解释：（1）丙酮酸释放引起不稳定的构象变化，二次失活（2）产物抑制低浓度的DQ。
Fig. 3的分光光度计测定数据区别了这两种解释。
改变实验中AOX蛋白量不影响时间依赖的酶失活。
这个观察指出，产物抑制是AOX 失活的一个不大可行的解释，当蛋白质数量增多时，人们希望加快DQ积累，因此加快了AOX失活速率。
实际上，酶活的半衰期与酶量无关。