第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。

构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。

亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。

PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。

但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。

第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。

限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。

甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。

并且能够保证自身的DNA不被降解。

使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。

如：HindIII限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。

II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。

其限制反应与甲基化反应是分开的反应。

不需要ATP的参与。

限制酶识别的序列长度？结构？答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。

回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。

但他们的切割位点有可能不同。

分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。

酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pHM g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。

酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法?答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。

中止的方法是在65℃下反应20min。

什么星星活性？抑制其发生的办法？答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。

抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。

影响酶活性的因素有？答：可分为内因和外因外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。

内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋）原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。

DNA聚合酶I的三种活性? 答：4、置换反应，若体系中只含有一种dNTP，那么会一直重复3过程，直至漏出与该dNTP互补的碱基。

总之在没有dNTP的情况下，外切酶活性占主导地位，而当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性将处在平衡状态中，结果使得双链DNA称为平末端。

切口平移法是什么？答：切口平移法是作为DNA聚合酶I 的一个应用，Klenow DNA 聚合酶是什么？有什么特征？有什么应用？答：Klenow DNA聚合酶是DNA聚合酶I去掉了5’-3’外切酶活性的一种聚合酶。

但其3’-5’端的外切酶活性保留。

因此应用更为广泛：T4噬菌体DNA聚合酶是怎么得到的？有什么活性？应用？答：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌。

其活性与KlenowDNA聚合酶相似，但是其3’-5’端外切核酸酶活性要强200倍。

且不从单链模板上置换引物，应用：耐热DNA聚合酶有那些？特征是？作用？答：耐热DNA聚合酶是指在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自噬高温的细菌，主要用于PCR反应。

有TaqDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等等。

DNA连接酶和DNA聚合酶作用方法相同吗？应用相同吗？答：作用方法都是催化磷酸二酯键的形成，但DNA连接酶是连接两个DNA片段，可以是环状DNA可以是单链DNA，而DNA聚合酶是作用一个一个的核苷酸，在复制中发挥作用。

反转录酶的来源和活性？答：来源于AMV（禽成髓细胞瘤病毒），含有两条多肽链，具有5’-3’DNA聚合酶活性和很强的RNase H活性。

后者的活性可以用于反转录后降解掉原RNA。

末端转移酶来源？活性？答：来源于小牛胸腺，是一种不寻常的DNA聚合酶，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。

在2价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端，改变DNA分子的末端序列。

连接酶有哪些？T4连接酶的作用过程？答：有T4 DNA连接酶、大肠杆菌连接酶、Taq连接酶、T4 RNA连接酶T4连接酶的作用过程：催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。

反应物为黏末端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。

低浓度的PEG和单价阳离子可以提高平末端连接速度。

T4多核苷酸激酶是什么？有什么活性？T4多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将ATP上的磷酸基团转移到DNA分子5’上。

具有两种活性：1、正反应：使本来没有磷酸基团的DNA5’磷酸化。

2、交换反应：使DNA分子5’的磷酸基团转移到ADP上，再让ATP上的磷酸基团转移到该DNA分子的5’上，发生交换反应。

将ATP上的磷酸基团标记，应用广泛。

此酶在高ATP浓度是发挥最佳，N H4+是其强烈抑制剂。

碱性磷酸酶的用途？答：他们均能催化除去DNA或RNA5’的磷酸的反应，通过去除5’磷酸基团，可以防止DNA 片段发生自连，或标记（5’）前除去DNA或RNA5’磷酸。

核糖核酸酶A的作用？作用方式?答：广泛用来除去DNA样品中的RNA。

除去DNA：RNA中未杂交的RNA区，可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。

核糖核酸酶H 的作用？答：特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3’羟基和5’磷酸末端的产物。

主要用于cDNA克隆合成第二链之前，除去RNA。

脱氧核糖核苷酸酶I的作用？应用？答：DNase I 来源于牛胰，是内切核苷酸酶，优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或者单链DNA。

在M g2+作用下，独立作用于每条DNA链，其切割位点随机。

有M g2+切割ds DNA同一位置，产生平末端或者1~2个核苷酸突出的DNA片段。

其用途广泛：切口平移标记时在ds DNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口，将分子截短；除去RNA样品中的DNA。

第三章分子克隆载体什么是载体？应具备有什么特征？答：将外源DNA或基因片段携带入宿主细胞的工具称为载体。

应具备以下特征：1、在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）2、必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制3、有一定的标记基因，用于筛选4、最好有较高的拷贝数，便于载体的制备。

基因克隆指什么？基因文库是怎样得到的？答：利用重组DNA技术分离目的基因的过程，称为基因克隆。

由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的所克隆构成的特殊群体，称之为基因文库。

大肠杆菌载体的复制与什么有关？答：其载体上一般带有Pmb1质粒与ColE1质粒的复制起始位点。

其RNAII的和成，与RNase H的作用有利于RNAII形成三叶草二级结构，从而引导质粒的复制。

而RNAI的合成能够阻断RNAII的二级结构的形成，ROP能够增强RNAI的作用。

因此削弱RNAI 与RNAII之间的作用有利于增加复制子的拷贝数严谨性质粒和松弛型质粒表示什么？答：严谨性质粒在每个细胞中的拷贝数有限，大约1~几个，而松弛型的拷贝数较多，可达几百。

氯霉素可以提高质粒拷贝数的原理？答：氯霉素或者壮观霉素能够抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制，而质粒能够继续复制，最终每个细胞中可以积聚2000-3000个质粒。

从而提高质粒的拷贝数质粒的不相容性和不相容群的定义？答：质粒的不相容性指的是，两个质粒不能够同时在同一个宿主中共存的现象。

它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。

不相容质粒一般都利用同一复制机制，从而导致不能共存于同一宿主中。

不相容群指那些由不相容质粒组成的一个群体，一般有相同的复制子。

那么质粒的拷贝数和质粒的不相容性相互矛盾吗？答：复制机制一样可理解为复制量受到的调控是一样的，但由于质粒长短和结构不一样，复制速率是不同的，所以在达到质粒复制量饱和时，复制快的必定占有更多比例，细胞分裂分配后，复制快的质粒就多一点。

细胞繁殖几代后，复制速率慢的质粒就接近于消失，这就是不相容原理。

1. 如果两种复制机制（复制起点附近区域序列）一样的质粒，复制速率也完全一样，那么它们是能一直共存的（但是要平分拷贝数，比如拷贝数是60，那么各自只有30）2. 复制机制不一样，也就是他们的质粒复制饱和量受不同因子调控，那么各自达到饱和量后再分配，互不影响，可以共存（不平分拷贝数，比如一个是60一个是20，那么总共有80）什么是质粒的转移性？答：质粒具有转移性。

在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主细胞内。

标记基因分为哪几类？答：按用途可分为１、选择标记基因2、筛选标记基因选择标记基因用于鉴别目的DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来：抗生素抗性基因是目前使用最广泛的标记基因，有：1、氨苄青霉素抗性基因2、四环素抗性基因3、氯霉素抗性基因筛选标记基因可以用于携带了外源DNA片段的的重组子挑选出来。

有：1、α互补（蓝白板筛选）2、插入失活蓝白板筛选（α互补）的原理是？答：质粒载体的种类有？作用？答：1、克隆载体：扩增DNA片段，保存DNA片段。

PUC18和PUC19是最常用的质粒载体，只有2686bp，结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA片段。

PBR322.目前是使用广泛的许多质粒载体几乎都是由此发展而来的2、表达载体：在克隆载体的基础上衍生而来，主要添加了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的原件。