一、绪论1、简述基因工程的概念。答：基因工程是指按照人们的设计，用生物技术直接操作生物的基因组。通过分离和拷贝目的基因或人工合成外源基因，在体外将外源基因插入到载体分子中，成为重组DNA，再导入宿主细胞内，进行扩增和表达。此过程所涉及的方法学称为重组DNA技术，也称分子克隆或基因操作。2、列举基因工程中常用的一些技术。答：（1）基因敲入：以ES细胞培养技术和同源重组为基础，通过转基因将外源基因整合到特定的靶位点，利用靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的异位表达。（2）基因敲除：将一个特地设计的DNA片段导入生物体中，通过同源重组使靶基因被置换出而失活的实验技术。（3）基因敲落：是用反义技术，RNAi等降低或抑制靶基因的表达活性。（4）基因打靶：是用同源重组来瞄准希望改变的特定内源基因。（5）基因组编辑：用基因组编辑核酸酶，如锌指核酸酶（ZFN）、归巢核酸内切酶、转录激活子样效应物（TALE）和成簇间隔短回文重复（CRISPR）进行剪切。二、基因工程的分子遗传学基础（一）名词解释1、基因表达：指DNA分子经转录产生互补的RNA分子。2、半保留复制：亲代DNA双链分离后的两条单链均可作为新链合成的模板，复制完成后的子代DNA分子的核苷酸序列均与亲代DNA分子相同，但子代DNA分子的双链一条来自亲代，另一条为新合成的链，故称为半保留复制。3、半不连续复制：是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。半不连续模型是DNA复制的基本过程。4、DNA的变性：指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变：溶液粘度降低、溶液旋光性发生改变、增色效应。5、DNA的复性：指变性DNA在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。6、增色效应：指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。7、凝胶电泳：以凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等）为支撑物的区带电泳。用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。（二）问答1、DNA复制过程中有哪些相关酶和蛋白？答：（1）DNA聚合酶：以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA。（2）引物酶：是RNA聚合酶的一种，用来引导RNA引物的合成，从而引导DNA聚合酶介导的DNA链的合成。（3）解螺旋酶：催化双链DNA解螺旋作用。（4）拓扑异构酶：通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数的酶。（5）单链结合蛋白：稳定DNA解开的单链,阻止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。2、简述RNA合成的特点。答：（1）以核酸核苷三磷酸（rNTP）为底物。（2）以DNA为模板。（3）按5’→3’方向合成。（4）无需引物的存在能单独起始链的合成。（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在。（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板。（7）RNA的序列和模板是互补的。3、简述RNA合成和DNA复制的区别。答：（1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板。（2）DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母链成为子链结合在一起，形成子链。（3）RNA合成不需引物，而DNA复制需引物。（4）转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP。（5）聚合酶系不同。4、简述限制性内切酶的概念，并列举基因工程中常用的几种工具酶。答：限制性内切酶是指识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。常用的工具酶有：限制性内切酶、连接酶、激酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶5、简述Southern和Northernblot，Westernblot的原理。答：（1）DNA印迹（Southernblotting）：用放射性同位素标记的单链DNA探针与尼龙膜上的DNA样本进行分子杂交。（2）RNA印迹（Northernblotting）：将RNA变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，用于与DNA探针杂交以鉴定其中特定RNA分子的大小与含量。不能用碱变性，因为碱会导致RNA的水解。（3）蛋白质印迹（Westernblotting）：经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。6、比较基因（Gene）和开放阅读框（ORF）两个概念内涵的异同答：（1）基因（Gene）：指产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。（2）开放阅读框（ORF）：以起始密码子开始，在三联体读框的倍数后出现终止密码子之间的一段序列。可读框有可能编码出一条多肽链或一种蛋白质。当没有已知蛋白质产物时，该区域被称为可读框，而当确知该可读框编码某一蛋白时，它就被称为编码区，即一个可读框是潜在的编码区。很多情况下，可读框即指某个基因的编码序列。（3）ORF仅仅是基因编码蛋白质的序列,基因应该还包括调控序列和其它非编码区,如调控序列等。

7、论述保证DNA复制精确性的原理

答：（1）复制时以一条链为模板进行半保留复制，且复制时严格按照碱基配对原则。（2）DNA聚合酶具有反向校读机制，在复制中对错配碱基进行校正。（3）DNA聚合酶可以将DNA链弯曲，防止非合成点对合成点的干扰。（4）复制完成后若存在错误，DNA会启动修复机制，包括错配修复(DAM甲基化酶)、切除修复(DNA切割酶)、重组修复(DNA切割酶聚合酶)、DNA直接修复(dna光解酶)、SOS系统等。（三）应用题某DNA的克隆片段用双脱氧法测序。部分的测序电泳胶的放射自显影如图所示：（1）推出由此引物合成的DNA链的序列。标出5’端和3’端答：5’-TTCGAAAGGTGACCCCTGGACCTTTAGA-3’（2）推出用来做为模板链的DNA的序列。标出5’端和3’端答：5’-TCTAAAGGTCCAGGGGTCACCTTTCGAA-3’（3）写出DNA双螺旋的序列。标出5’端和3’端答：5’-TCTAAAGGTCCAGGGGTCACCTTTCGAA-3’3’-AGATTTCCAGGTCCCCAGTGGAAAGCTT-5’（4）简述双脱氧测序法的原理答：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。三、原核生物分子克隆的宿主和载体系统（一）名词解释1、分子克隆：指一个基因被克隆的过程。在基因工程上，分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。2、质粒plasmid：指一种在原核生物中常见的能够在染色体外自主复制的DNA分子，附加到细胞中的非细胞染色体或核区DNA，依赖宿主的酶来维持和复制。根据质粒转移的特点，可以分为结合型质粒和非接合型质粒。3、转化：将外源DNA转移到宿主细胞的过程。4、噬菌体：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体，由蛋白质外壳和核酸组成。5、噬菌体展示技术：将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面的技术，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，展示在噬菌体的表面。6、乳糖操纵子：参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。（二）问答题1、分子克隆中的重要工具答：（1）DNA克隆载体，如T载体、pET系列载体等（2）细菌DNA转化方法，如氯化钙诱导、电穿孔等（3）用于DNA复制的特殊大肠杆菌品系，如DH5α、BL21、BIR等3、描述lac操纵子的结构和调控特征答：（1）结构：LacZ（编码β-半乳糖苷酶）、LacY（编码半乳糖苷渗透酶）、LacA（编码半乳糖苷转酰酶）、操纵序列LacO、启动子LacP、编码组合蛋白的基因LacI、CAP或CRP结合位点。（2）调控特征：乳糖操纵子的转录起始受到CAP和阻遏蛋白的双重调控，即正、负调控。①CAP（正调控）：通过结合到启动子上游CAP结合位点，促进RNApol与P的结合，进行有效的转录，产生mRNA，合成更多的β-半乳糖苷酶和透过酶。②阻遏蛋白（负调控）：调节基因I产生的阻遏蛋白结合到操纵基因O上，由于启动子p与操纵基因有一定的重叠，妨碍RNApol与P结合，抑制了结构基因的转录。3、基因工程中常用α-互补来筛选重组质粒，请说明其原理答：许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ′基因。LacZ′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段。宿主和质粒